Trabekulektomie zur Behandlung des Glaukoms: Die in-vitro Wirkung von Viskoelastika auf humane Tenon-Fibroblasten auch in Kombination mit Mitomycin C

Aus dem Zentrum für Augenheilkunde der Universität zu Köln Klinik und Poliklinik für Allgemeine Augenheilkunde Geschäftsführender Direktor: Herr Universitätsprofessor Dr. med. C. Cursiefen

Trabekulektomie zur Behandlung des Glaukoms: Die in-vitro Wirkung von Viskoelastika auf humane Tenon-Fibroblasten auch in Kombination mit Mitomycin C

Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Hohen Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln

vorgelegt von Henning Robert Stetefeld aus Köln

Promoviert am 19.10.2011

1

Dekanin / Dekan:

Universitätsprofessor Dr. med. Dr. h.c. Th. Krieg

1. Berichterstatter:

Privatdozent Dr. med. A. Hueber

2. Berichterstatter:

Universitätsprofessor Dr. med. S. Herzig

Erklärung

Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht.

Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Erstellung des Manuskriptes habe ich Unterstützungsleistung von folgenden Personen der Universitäts-Augenklinik Köln erhalten:

Herrn Privatdozent Dr. med. Arno Hueber, Oberarzt der Universitätsklinik für Augenheilkunde.

Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt. Insbesondere habe ich nicht die Hilfe eines Promotionsberaters in Anspruch genommen. Dritte haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorliegenden Dissertation stehen.

Die Arbeit wurde von mir bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt und ist auch noch nicht veröffentlicht.

Köln, den 05.02.2011

(H. Stetefeld)

2

Danksagung

Herrn Universitätsprofessor Dr. med. G.K. Krieglstein danke ich für die Erlaubnis, die vorliegende Arbeit in seinem Hause durchzuführen.

Herrn Privatdozent Dr. med A. Hueber danke ich für die Überlassung des Themas, seiner wissenschaftlichen Betreuung und seiner Hilfe bei der Besprechung der Ergebnisse.

Nicht zuletzt gelten mein Dank Frau Martina Becker (MTA), die mir bei Problemen und Sachfragen zu jeder Zeit mit Rat und Tat zur Seite stand sowie Frau Kathrin Kuhr (Dipl.Stat.), die mir in statistischen Sachfragen behilflich war.

3

Meiner Familie in Dankbarkeit

4

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

8

1

Einleitung

11

1.1

Das Glaukom

11

1.2

Risikofaktoren, Diagnostik

13

1.3

Klassifikation

14

1.4

Therapie

17

1.4.1 Medikamentöse Therapie

17

1.4.2 Laserbehandlung

18

1.4.3 Invasiv chirurgische Verfahren

20

1.5

Mitomycin C

24

1.6

Viskoelastika

27

1.6.1 Hyaluronsäure

27

1.6.2 Hyaluronidase

30

1.6.3 Hydroxypropylmethylcellulose

32

1.7

Apoptose

33

1.8

Fragestellung

37

2

Material und Methoden

39

2.1

Humane Tenonfibroblasten

39

2.2

Zellkultur und Subkultivierung

39 5

2.3

Abläufe der Inkubationsexperimente

42

2.3.1 Aussähen der Zellen in 96-Well-Platten

42

2.3.2 Kultivierung der Zellen für Western Blot-Versuche

43

2.3.3 Reagenzien für Inkubationsversuche

44

2.4

Bestimmung der Zellzahl mittels Crystal-Violett

48

2.5

Caspase-3 Aktivitätsmessung

49

2.6

Western Blot

50

2.6.1 Proteinquantifizierung

50

2.6.2 SDS-PAGE

52

2.6.3 Blotten

54

2.6.4 Gegenfärbung mit Poneau-S

55

2.6.5 Immunreaktion

56

2.7

Statistik

57

3

Ergebnisse

59

3.1

Konzentration und Wirksamkeit von Mitomycin C

59

3.2

Crystal-Violett-Assay

61

3.2.1 Exemplarisches Ergebnis aus Einzelversuch

61

3.2.2 Ergebnis aus 5 Messreihen

66

3.2.3 Zusammenfassung der Crystal-Violett-Versuche

71

3.3

72

Caspase-3 Aktivitätsmessung

3.3.1 Caspase-3 Aktivitätsmessung nach 24 Stunden Inkubation unter Versuchsbedingungen

73 6

3.3.2 Zusammenfassung der Caspase-3 Aktivitätsmessung

74

3.4

75

Western Blots

3.4.1 Bax

75

3.4.2 Bcl-2

76

3.4.3 p53

77

3.4.4 Zusammenfassung der Western Blot-Analysen

78

4

Diskussion

79

4.1

Grundlagen der Mitomycin C Wirkung

81

4.2

Nachweis einer veränderten Mitomycin C Wirkung durch viskoelastische Gele

83

4.3

molekularbiologische Betrachtungen von Hyaluronsäure

85

4.4

Resümee

91

4.5

Ausblick

92

5

Zusammenfassung

93

6

Literaturverzeichnis

94

7

Lebenslauf

120

7

Abkürzungsverzeichnis

Abb.

Abbildung

AMC

7-Amino-4-Methyl-Coumarin

BCA

Bicinchoninacid = Bicinchoninsäure

bzw.

beziehungsweise

ca.

circa

CD

cluster of differentiation

cm

Zentimeter

DISC

death-inducing signalling complex

DNS

Desoxyribonukleinsäure

ELISA

enzyme linked immunosorbent assay

ERK

extrazellulär regulierte Kinase

ERM

Ezrin-Radexin-Moesin

et al.

et alii = und andere

EZM

Extrazellularmatrix

5-FU

5-Fluoruracil

GAG

Glykosaminoglykane

HA

Hyaluronic acid = Hyaluronsäure

HAS

Hyaluronsäuresynthase

HPMC

Hydroxypropylmethylcellulose

ICAM

IntraCellular Adhesion Molecule-1

I.E.

Internationale Einheit 8

IOD

intraokulärer Druck

i.v.

intravenös

kDa

Kilodalton

MAP

mitogen-activated-protein

Mio.

Millionen

mM

millimolar

MMC

Mitomycin C

mg

Milligramm

ml

Milliliter

mm

Millimeter

mmHg

Millimeter Quecksilbersäule

NDG

Normaldruckglaukom

NGF

Nerve Growth Factor

o.g.

oben gennant

PCOG

Primär chronisches Offenwinkelglaukom

ROS

Reactive Oxygen Species = Sauerstoffradikale

RT-PCR

real-time poly chain reaction

SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophorese

sog.

sogenannt

TNF

Tumornekrosefaktor

u.a.

unter anderem

VEGF

vascular epithelial growth factor

WHO

World Health Organisation 9

z.B.

zum Beispiel

z.T.

zum Teil

10

1 Einleitung

1.1 Das Glaukom

Das Glaukom (griech.: glaukós = grau, silbrig), im Deutschen auch umgangssprachlich „grüner Star“ genannt, steht als Sammelbegriff für ätiologisch unterschiedliche Erkrankungen, deren gemeinsame Endstrecke die Optikoneuropathie ist und in deren Verlauf es zu einem charakteristischen Papillenbefund, Gesichtsfelddefekten und schließlich völliger Erblindung kommen kann [71]. Neben einem erhöhten Augeninnendruck, welcher früher noch als einziger Faktor zur Glaukomentstehung galt, werden vaskuläre Dysregulationen im Auge und der systemische Blutdruck als weitere wichtige Faktoren in ein Erklärungsmodell zur Pathogenese mit einbezogen. So tritt das Glaukom als erhöhter Augeninnendruck mit und ohne glaukomatösem Schaden in Erscheinung, genauso wie erwähnte Optikoneuropathie ebenfalls mit und ohne Drucksteigerung auftreten kann.

Epidemiologie: Das Glaukom ist nach dem Diabetes mellitus die zweithäufigste Erblindungsursache der industrialisierten Welt, knapp 1/5 aller Erblindungen sind auf das Glaukom zurückzuführen. Weltweit sind 73 Millionen Menschen vom Glaukom betroffen bzw. weisen einen IOD von über 21mmHg auf. Laut WHO liegt die Zahl sogar noch höher mit ca. 107 Mio. Betroffenen, da eine enorme Dunkelziffer besteht [121]. Die Prävalenz der manifesten Erkrankung liegt in der Bundesrepublik Deutschland bei 1%. Das Glaukom ist eine Erkrankung vor allem der zweiten Lebenshälfte, so misst man bei 10% aller über 40jährigen bereits einen okulären Hypertonus, also einen wichtigen Risikofaktor zur Entstehung dieser Erkrankung. Knapp 2% dieser Altersgruppe leiden bereits am Glaukom [68].

11

Pathomechanismus: Der individuell zu hohe intraokuläre Druck (IOD) spielt pathophysiologisch, sowohl in der Diagnostik als auch in der Therapie des Glaukoms eine entscheidende Rolle. Im Normalfall liegt er zwischen 8 mmHg und 21 mmHg mit einem Mittelwert von 15 mmHg. Die tageszeitlichen Schwankungen liegen dabei nicht höher als 5 mmHg. Die höchsten Werte misst man zum einen bei älteren Personen und zum anderen in der Nacht oder ersten Tageshälfte. Der normale IOD gewährleistet die optische Abbildung durch Formgebung des Augapfels, Wölbung der Kornea und Glättung der Retina. Der Augeninnendruck ist abhängig von der Kammerwassermenge und diese wiederum vom Verhältnis zwischen Kammerwasserproduktion und Abfluss. Das aus Blutplasma gewonnene Filtrat wird durch die pigmentierten Zotten des Ziliarkörpers aktiv, pulsatil in die Hinterkammer sezerniert und gelangt über die Pupille in die Vorderkammer, indem es den Pupillarwiderstand (1. physiologischer Widerstand) überwindet, welcher von der Enge zwischen Linse und der ihr aufliegender Iris herrührt. Der Abfluss erfolgt über die gesamte Zirkumferrenz im Kammerwinkel zum einen über ein uveosklerales Gefäßsystem der Chorioidea in den allgemeinen venösen Kreislauf und zum anderen größten Teil über das Trabekelwerk (Trabeculum cornesclerale) in den Schlemm´schen Kanal und schließlich in episklerale Gefäße [71]. Das Trabekelwerk gilt als 2. physiologische Barriere des Abflusses. Nicht eine zu hohe Kammerwasserproduktion, sondern eine Behinderung des Kammerwasserabflusses ist letztlich der Grund für die Augeninnendruckerhöhung, die die typischen Veränderungen des Sehnerven bzw. der Papille hervorruft. Man geht davon aus, dass die Nervenfasern sowohl direkt durch die mechanische Wirkung abgeknickt und geschädigt werden als auch durch eine druckbedingte oder arteriosklerotisch bedingte Minderperfusion [48] zu Grunde gehen. Der Schwund der Optikusfasern zeigt sich langfristig in der für das Glaukom typischen Exkavation der Papille und der zunehmenden Gesichtsfeldeinschränkung der Betroffenen.

12

1.2

Risikofaktoren, Diagnostik

Das Glaukom ist in der Regel eine Erkrankung des höheren Lebensalters, mit zunehmendem Alter steigt die Prävalenz exponentiell. Daneben wurde eine erbliche Prädisposition nachgewiesen. Auch ethnische Faktoren spielen eine Rolle: so haben Schwarze ein vierfach höheres Erkrankungsrisiko als Weiße beim primären Offenwinkelglaukom, und Asiaten erkranken häufiger am Winkelblockglaukom. Weitere Risikofaktoren sind unter anderem Augenentzündungen mit Schädigung des Trabekelwerks, Kortisontherapie oder starke Myopie u.a.. Immer mehr in den Vordergrund rücken auch vaskuläre Risikofaktoren (z.B. Arteriosklerose), die eine systemische vaskuläre Dysregulation und damit Durchblutungsveränderungen direkt am Nervus opticus und der Retina hervorrufen [93]. Hiermit erklärt sich, wie auch bei normalem oder sogar niedrigem Augeninnendruck glaukomatöse Schäden entstehen können.

Diagnostik: Durch die Spaltlampenuntersuchung kann sich der Untersucher einen Eindruck von der Vorderkammertiefe machen, die bei einer zu starken Abflachung zu einem engen Kammerwinkel prädisponiert. Durch die Gonioskopie kann dieser besser beurteilt werden und ermöglicht eine genauere Klassifizierung des Glaukoms. Durch die einfache Bulbuspalpation kann nur im Falle eines akuten Winkelblockglaukoms mit extrem hohem IOD (60-70mmHg) ein sehr harter Augapfel getastet werden. Des Weiteren gibt es mehrere Messmethoden zur Augendruckmessung wie z.B. die Impressionstonometrie nach Schiötz oder die Luftstoß-Non-Contact-Tonometrie. Die genaueste und weitverbreitetste Methode ist die Applantionstonometrie nach Goldmann, bei der die anästhesierte Hornhaut durch einen Druckkörper so weit eingedrückt wird, bis sich die Messmarkierungen in Form von zwei Fluoreszeinhalbkreisen im Spaltlampenlicht auf der Kornea berühren. Der aufgewendete Druck entspricht dem Augeninnendruck. Die Hauptfehlerquelle bei der Tonometrie liegt in der Nichtbeachtung der Hornhautdicke des Patienten [47]. Bei dicker Kornea werden zu hohe und bei dünner Kornea zu niedrige Drücke gemessen, hier muss je nach Abweichung von der Norm das Messergebnis korrigiert werden. Um ein verlässliches Bild des IOD zu bekommen, ist die Anfertigung eines Tagesdruckprofils häufig nötig.

13

Die Ophtalmoskopie der Papille spielt eine wichtige Rolle in der Diagnostik des Glaukoms, da hier die glaukomatösen Veränderungen auch ohne erhöhten Augeninnendruck zu erkennen sind und diese Veränderungen auch auftreten bevor der Sehverlust klinisch auffällt. Eine Frühdiagnose ist also möglich bevor der Patient subjektiv eine Veränderung bemerkt oder Gesichtsfeldausfälle in der Schwellenwert-Perimetrie gemessen werden können. Die glaukomatöse Papille ist hochoval über das physiologische Maß hinaus exkaviert (Abweichung von der ISNT-Regel), Gefäße knicken am Papillenrand ab und die Papille erscheint abgeblasst. Die glaukomatöse Gesichtsfeldeinschränkung durchläuft sechs Stadien nach Aulhorn wobei sich ein lange vom Patienten unbemerktes, parazentrales Skotom immer weiter bogenförmig, sektoriell ausbreitet (Bjerrum-Skotom) bis schließlich auch die zentrale Sehschärfe betroffen ist und der Patient erblindet.

1.3

Klassifikation

Für das Glaukom bestehen verschiedene Kriterien, nach denen es eingeteilt werden kann. Eine erste grobe Differenzierung erfolgt in ein primäres, also eigenständiges, oder ein sekundäres, also aus einer anderen Erkrankung des Auges entstandenes, Glaukom. Darüber hinaus wird je nach Kammerwinkelöffnung unterschieden zwischen Offenwinkelglaukom und Winkelblockglaukom und je nach Verlauf der Erkrankung zwischen akutem oder chronischem Glaukom. Eine weitere Unterteilung nach Lebensalter in kongenitales, infantiles und juveniles ist ebenfalls gängig.

Primäres Offenwinkelglaukom: Das primäre chronische Offenwinkelglaukom (PCOG, Glaucoma chronicum simplex) ist eine langsam progrediente Erkrankung meist beider Augen mit der typischen Optikoneuropathie und Gesichtsfeldausfällen. Durch eine langfristige Erhöhung des Abflusswiderstandes im Trabekelwerk (2. physiologische Barriere) bei sonst offenem bzw. weitem Kammerwinkel steigt der Augeninnendruck und die Nervenfasern werden geschädigt [45]. Warum das Trabekelmaschwerk versteift und nicht mehr suffizient das Kammerwasser in den Schlemm'schen 14

Kanal transportiert, ist nicht völlig geklärt. Man macht hyaline Ablagerungen im Trabekelwerk dafür verantwortlich [47]. Das PCOG ist mit 90% die bei Weitem häufigste Glaukomform. Schwarze erkranken früher als Weiße und eine genetische Prädisposition ist nachgewiesen. Die Patienten bemerken die schleichende Erkrankung in der Regel über viele Jahre nicht. Einen Sonderfall stellt die okuläre Hypertension dar, unter der trotz grenzwertig erhöhtem IOD keine Sehnervenschäden bestehen und somit definitionsgemäß auch noch kein Glaukom vorliegt. Es besteht jedoch ein deutlich erhöhtes Risiko, dass sich aus der okulären Hypertension ein manifestes Glaukom entwickelt.

Nomaldruckglaukom (NDG): Im Gegensatz zum PCOG findet man beim Normaldruckglaukom definitionsgemäß keine erhöhten Augeninnendrücke, jedoch sind die Gesichtsfeldausfälle und Papillenveränderungen glaukomtypisch und begleitet von Papillenrandblutungen und Veränderungen der Bindehautgefäße. Die Pathogenese ist nicht gänzlich erklärt, doch wird eine besonders nächtliche vaskuläre Dysregulation mit Minderperfusion des Papillenkopfes als ursächlich für die glaukomatöse Atrophie angesehen [32, 15]. So findet sich bei Patienten mit kardiovaskulären Ereignissen (Herzinfarkt, Vasospasmen) bzw. Risikofaktoren (Diabetes mellitus, arterielle Hypertonie) ein deutlich höheres Risiko an einem NDG zu erkranken [90].

Primäres Winkelblockglaukom: Beim primären Winkelblockglaukom oder Pupillarblockglaukom handelt es sich um eine Verlegung des Kammerwinkels durch periphere Irisanteile, wodurch der Kammerwasserabfluss bei normaler Kammerwasserproduktion und auch normalem trabekulärem Widerstand behindert wird und der IOD anfallsartig um ein Vielfaches der Norm anwächst. Grundlegend ist ein zu hoher Widerstand an der 1. physiologischen Abflussbarrierre zwischen Iris und Linse, man spricht vom Pupillarblock. Durch den konsekutiven Druckanstieg in der Hinterkammer werden die peripheren Irisanteile nach vorne, vor den Kammerwinkel geschoben und verschließen den Abfluss. Eine flache Vorderkammer ist prädisponierend für einen Pupillarblock. Weitere Faktoren sind ein hohes Lebensalter, weibliches Geschlecht und Mydriasis (bei Dunkelheit, durch Medikamente bedingt). Der Druckanstieg kann intermittierend oder chronisch sein, tritt aber in der Regel akut auf und die Patienten berichten über starke einseitige Augen15

und Gesichtsschmerzen, Übelkeit und Sehstörungen mit sog. Halos und Verschwommensehen. Dieser Glaukomanfall ist stets ein Notfall und bedarf einer sofortigen augenärztlichen Behandlung. Die kausale Therapie des akuten Winkelblockglaukoms ist operativ, wird jedoch konservativ eingeleitet.

Sekundäres Offenwinkelglaukom: Bei den sekundären Offenwinkelglaukomen sind die anatomischen Beziehungen zwischen Iris, Tabekelwerk und peripherer Hornhaut intakt, jedoch kommt es aus unterschiedlichen Gründen zu einer Verlegung des Trabekelwerks und der Abflusswiderstand steigt [48]. Bei dem Pigmentdispersionsglaukom kommt es z.B. zu einer Lösung von Pigmentgranula aus dem Ziliarkörper, welche sich im Trabekelwerk ablagern. Ein anderes Beispiele ist das Pseudoexfoliationsglaukom bei dem es zu Mukopolysaccharidablagerungen kommt. Entzündungen des Auges setzen ebenfalls Proteine, aber auch Zellen frei, die in den Kammerabfluss gelangen und seine Funktion behindern können.

Sekundäre Glaukome: Die Verlegung des Trabekelwerks tritt z.B. beim sog. Neovaskularisationsglaukom auf [71]. Es hat eine schlechte Prognose. Hierbei kommt es durch retinale Ischämie bei z.B. Retinopathia diabetica oder Zentralvenenverschluss VEGF-vermittelt zu Gefäßneubildungen und Ausbildung einer Rubeosis iridis und einer progressiven Verlegung des Kammerwinkels mit Gefäßen und einer fibrovaskulären Membran. Beim traumatischen Glaukom wird der Abflussweg durch Blut im Kammerwinkel und/oder eine subluxierte Linse behindert, Synechien können als Spätfolge auftreten und ebenfalls zum Glaukom führen.

Kongenitale Glaukome: Als Überbleibsel der Embryonalentwicklung überzieht beim Neugeborenen unreifes mesodermales Gewebe (Barkan-Membran) den Kammerwinkel und behindert so den Abfluss. Die Säuglinge fallen durch einen Buphthalmus, Epiphora, und Hornhauttrübung auf. Die Verer16

bung ist meist autosomal-rezessiv mit geringer Penetranz, Jungen sind häufiger betroffen als Mädchen, die Erstmanifestation liegt meist im 1. Lebensjahr. Die frühe Diagnose eines kongenitalen Glaukoms ist äußerst wichtig. Die Therapie ist primär chirurgisch.

1.4

Therapie

Die Therapie des Glaukoms hat zum Ziel den Augeninnendruck wieder zu normalisieren und, sofern möglich, Ursachen der IOD-Erhöhung zu beseitigen und so die Progression der Erkrankung zu stoppen. Es stehen hierfür drei Therpieansätze zur Verfügung: 1. Medikamentöse Therapie 2. Laserbehandlung 3. Invasiv chirurgische Maßnahmen Indikationen zum Therapiebeginn sind jeweils einzeln oder zusammen: Augeninnendruckerhöhungen oder Schwankungen, glaukomatöse Papillenveränderungen und Gesichtsfeldeinschränkungen.

1.4.1 Medikamentöse Therapie

Die medikamentöse Therapie kann auf drei Wegen den IOD senken: 

Verbesserung des Kammerwasserabflusses (uveoskleral oder trabekulär),



Hemmung der Kammerwasserproduktion und



Volumenminderung am Auge durch osmotisches Gefälle.

Dabei stehen mehrere Wirkstoffgruppen und Präparate zur Verfügung. Die Medikamentenwahl hängt ab von Wirksamkeit, vom Nebenwirkungsprofil (z.B. auch Konservierungsstoffe) und Kontraindikationen (z.B. keine beta-Blocker bei Asthma oder bestimmten Herzerkran17

kungen) unter Berücksichtigung individueller Patientenmerkmale (Alter, Linsentrübung, Begleiterkrankungen). Lokal applizierbare Medikamente sind in der Regel den systemischen vorzuziehen. Zur Verbesserung des Kammerwasserabflusses stehen Parasympathomimetika/Miotika (direkt/indirekt), Prostaglandinanaloga (z.B. Latanoprost) und Sympathomimetika (Adrenalinderivate) zur Verfügung. Die Kammerwasserproduktion wird durch Sympathomimentika (Clonidin), Sympatholytika (beta-Blocker, Guanethidin) und Carboanhydrasehemmer (z.B. Dorzolamid) verringert. Bei ber Behandlung von Glaukomanfällen haben sich systemisch wirksame Osmotika (Mannit) bewährt. Durch die Therapie wird eine Drucksenkung um mindestens 30% des Ausganswertes bzw. in den Normalbereich und die Beseitigung von Druckschwankungen als Ziel angesehen. Der Zielbereich liegt für gewöhnlich um 15 mmHg; je stärker der Papillenschaden, desto niedriger ist der anzustrebende Augeninnendruck. Es wird in der Regel versucht, dies mit nur einem Präparat zu erreichen, doch müssen nicht selten Kombinationstherapien durchgeführt werden. Bewährt hat sich z.B. die Kombination von Carboanhydrasehemmer (z.B. Latanoprost) und beta-Blockern (z.B. Timolol). Der Therapieerfolg ist sehr von der Patientencompliance abhängig, welche häufig durch die ein bis mehrmals tägliche Applikation, Nebenwirkungen und die langjährige bzw. lebenslange Therapie schwindet.

1.4.2 Laserbehandlung

Die Laserbehandlung nimmt eine Zwischenstellung in der Therapie des Glaukoms ein. Sie wird als Folge oder Ergänzung der medikamentösen Therapie eingesetzt, wenn diese nicht ausreichend ist um den IOD zu senken oder das Medikament schlecht vertragen wird und ein fistulierendes, operatives Verfahren (noch) nicht in Frage kommt.

18

Argon-Lasertrabekuloplastik Mit diesem Laser werden an bis zu 100 Punkten des Trabekelwerks über die gesamte Zirkumferrenz Narben gesetzt, die durch ihren Zug das Trabekelmaschenwerk aufweiten und den Kammerabfluss verbessern. Vorteile dieses Verfahrens sind die schnelle und schmerzfreie Durchführung und die geringe Komplikationsrate. Eine Drucksenkung von 5-8 mmHg ist möglich, jedoch sprechen nur knapp 2/3 der Patienten auf die Therapie an und der Effekt hält häufig nicht länger als 2-3 Jahre an. Dieses Verfahren kann beim primären Offenwinkelglaukom, beim Pseudoeexfoliationsglaukom und beim Pigmentdispersionsglaukom angewandt werden und stellt eine Ergänzung einer maximalen medikamentösen Therapie dar [69, 34, 48, 71]. Zu den häufigeren Komplikationen zählen eine passagere Drucksteigerung kurz nach dem Eingriff, eine frühe Iritis sowie periphere vordere Synechien im Verlauf [69].

ND-YAG-Iridotomie Mit Hilfe des Neodym-Yttrium Aluminium Garnet Laser kann durch eine mechanische Gewebszerreißung ein Loch im oberen Anteile der peripheren Iris erzeugt werden, so dass ein Hinterkammer-Vorderkammer-Shunt entsteht. Diese Laserbehandlung stellt also eine schonende Alternative zur operativen peripheren Iridektomie dar, bei der das Auge eröffnet wird [109]. Dieses Verfahren eignet sich für die Prävention eines Winkelblockglaukoms bei Engwinkelsituation, eine prophylaktische Iridotomie am Partnerauge nach Winkelblockglaukom der Gegenseite, sowie bei inversem Pupillarblock bei Pigmentdispersionssyndrom.

Zyklophotokoagulation Bei diesem Verfahren zielt man auf die Verödung des kammerwasserproduzierenden Ziliarkörpers ab. Mit Hilfe eines Neodymium-YAG-Lasers, für dessen Licht die Sklera transparent ist, wird der Ziliarkörper koaguliert und so durch Verringerung der Kammerwasserproduktion der IOD ohne Eröffnung des Auges gesenkt [48]. Daraus ergibt sich jedoch die Gefahr einer Hypotonie mit all ihren Komplikationen bis zur Erblindung. Aufgrund der Irreversibilität dieses Verfahrens sollte es am Ende der Therapieoptionen stehen [71].

19

1.4.3 Invasiv chirurgische Therapie

Auch die operative Therapie hat das Ziel das Fortschreiten der Erkrankung durch eine Augeninnendrucksenkung aufzuhalten und das Sehvermögen zu erhalten. Diese Drucksenkung wird wiederum durch eine Verbesserung des Kammerwasserabflusses bzw. Schaffung neuer Abflusswege erreicht. Allgemeine Hauptindikationen die zu einer Entscheidung für eine operative Behandlung führen sollten, sind ungenügende Regulierung des IOD über 24 Stunden mit Medikamenten oder Lasertherapie und daraus resultierende Progredienz des Glaukoms, Unverträglichkeit der Lokaltherapie oder durch sie bedingte Komplikationen und Anwendungsschwierigkeiten der Lokaltherapie. Daneben spielt die Drucktoleranz des Sehnerven, die individuellen Patientenfaktoren wie z.B. Lebenserwartung, Glaukomstadium, kardiovaskulärer Status u.v.m., eine weitere Rolle [69].

Fistulierende Operationen Bei diesen Operationsverfahren wird der Augapfel eröffnet, man spricht auch von perforierenden Operationen oder Filtrationsoperationen. Die Grundlage für die heute gängigen fistulierenden Operationstechniken bildet wohl die von Elliot 1913 beschriebene Goniotrepanation, mit der ähnlich wie heute das System des Schlemm-Kanals umgangen und eine dauerhafte Verbindung zwischen Vorderkammer und subkonjunktivalem Bindegewebe hergestellt wird. Im Laufe des letzten Jahrhunderts erfuhr dieses Verfahren viele Modifikationen und Verfeinerungen. Schließlich kann heute die Trabekulektomie nach Cairns [17, 16] bzw. die Goniotrepanation mit Skleradeckel nach Fronimopoulos [37, 38, 39] als Standardverfahren der mikrochirurgischen Therapie angesehen werden, auch wenn zahlreiche Varianten existieren.

Goniotrepanation/Trabekulektomie Gemeinsames Kennzeichen aller Varianten ist die Exzision eines Stückchens corneoskleralen Gewebes angrenzend an das Trabekelwerks, wonach der Exzisionsort mit einer Skleralamelle gedeckt wird. Durch die Exzision kann Kammerwasser unter die Bindehaut abfließen, wo sich ein Filterkissen bildet. 20

Eine Trabekulektomie läuft heute z.B. wie folgt ab: Die Bindehaut wird ca. 8-9 mm am oberen Limbus eröffnet und in dessen Richtung freipräpariert. Dies ergibt einen großen Bindehautlappen, der die Bildung eines Filterkissens zwischen Bindehaut und Episklera ermöglicht. Die Tenon-Kapsel wird abpräpariert um eine bestmögliche Übersicht über den anatomischen und chirurgischen Limbus zu erlangen. Die hierbei durchgeführte episklerale Kauterisation dient zwar neben der Blutstillung auch der Zerstörung von Bindegewebe bzw. Fibroblasten und soll einer späteren Vernarbung des Filterkissens entgegenwirken, birgt aber das Risiko bei übermäßiger Kauterisation ins Gegenteil umzuschlagen und durch Nekrosebildung und Entzündungsreaktion einen bindegewebigen Umbau zu begünstigen. Der Einsatz von Antimetaboliten bzw. Mitomycin C hat sich an dieser Stelle bewährt. Als nächster Schritt werden die Umrisse der Skleralamelle (nach Cairns rechteckig 3x3mm) auf die halbe Skleradicke vorgeritzt und die Lamelle schließlich mit dem Hockeymesser bis in die klare Hornhaut präpariert. Die Blau-Weiß-Grenze dient zur Orientierung als Mittelpunkt des gewünschten Trabekulektomieareals, damit der Schlemm´sche Kanal und das davor liegende Trabekelwerk sicher entfernt werden. Schließlich wird das 1x1mm große corneosklerale Gewebsstück mit der Schere entfernt und die prolabierte basale Iris inzidiert (basale Iridektomie). Schließlich erfolgt die Deckung der Fistel mit der Skleralamelle, die in ihrer ursprünglichen Position durch Nähte wieder fixiert wird. Ebenso wird der Bindehautlappen zurückgeführt und die Wunde mit resorbierbaren Fäden verschlossen. Die Operation wird durch subkonjunktivale Injektion eines Antibiotikums und eines löslichen Steroids sowie Aufbringen einer zykloplegischen und antibiotischen Salbe beendet. Der Einsatz von Antimetaboliten wie Mitomycin C oder 5-FU während der Operation und ein besseres Verständnis der Wundheilungsreaktion haben die Erfolgsraten der Trabekulektomie verbessert [61]. Der Abfluss des Kammerwassers erfolgt nach dem Eingriff sowohl an den Rändern der Skleralamelle vorbei als auch durch die Skleralamelle selbst per diffusionem oder Kollektorkanäle in den Subkonjunktivalraum [113, 69]. Das Filterkissen dient als Zwischenreservoir für das Kammerwasser und stellt sich im Idealfall als eine physiologisch vaskularisierte Bindehauterhebung am Limbus dar. Nach Abschluss der Wundheilung wird das Kammerwasser über mehrere Wege aus dem Filterkissen drainiert. Fluoreszeinaufnahmen nach Vorderkammerfüllung und Fluoreszeinangiographien zeigten das neu gebildete Blutgefäße, Lymphgefäße und atypische, neu gebildete, Kammerwasservenen den Abfluss gewährleisten [9, 10, 69]. In einem funktionierenden Filterkissen ist im Bereich des Skleradeckelareals das Epithel normal dick und das subepitheliale Bindegewebe locker organisiert mit verstreutem Kollagen und 21

kleinen Zwischenräumen im Stroma. Ein Filterkissen verliert seine Funktion, wenn es im Bereich der äußeren Fistel, also im Skleradeckelareal, zu Vernarbungen kommt, die mit einem dichteren und dickeren subetpithelialem Bindegewebe mit einem hohen Gehalt an Kollagen mit paralleler Fibrillenanordnung einhergehen und so die Flußrate des Kammerwassers durch das Gewebe sinkt und eine Augendruckkontrolle nicht mehr gewährleistet wird. Weiter wurden in funktionslosen Filterkissen im späteren Verlauf mehrere „korkenzieherartige“, durchlässige Blutgefäße und wenige Fibroblasten im Bindegewebe entdeckt [62]. Die Frühphase des Funktionsverlustes ist in der Regel mit einer hyperzellulären Antwort durch aktivierte Fibroblasten verbunden, später ist ein zellarmes Bild mit dichten Kollagenlamellen charakteristisch [1, 6, 31, 47, 83]. In bis zu 25% der Fälle kommt es zu einer Vernarbung mit partiellem oder vollständigem Verschluss des Sickerkissens [48]. Der Einsatz von Antimetaboliten hat diesen Anteil enorm senken können, jedoch können hierdurch weitere Komplikationen entstehen [62]. Die Trabekulektomie ist heutzutage der bei Weitem häufigste operative Eingriff beim Glaukom und wird in der Regel beim Offenwinkelglaukom durchgeführt, weitere Indikationen sind das Pseudoexfoliationsglaukom oder das traumatische Glaukom [48]. Die Trabekulektomie hat eine Erfolgsquote von 80-85% [30, 71]. Komplikationen dieses Verfahrens sind mannigfaltig aber glücklicherweise auch verhältnismäßig selten. Sie reichen von intraoperativen Blutungen, Bindhautperforationen, oder gar Glaskörperverlust über früh-postoperative Augeninnendruckerhöhung, Vorderkammerabflachung (durch Druckunterschiede zwischen Vorder- und Hinterkammer im Sinne eines Ziliarblocks oder ungenügende Kammerwasserproduktion) oder Hyphäma bis hin zu spätpostoperativen großen zystischen Filterkissen, intraokuläre Hypotonie, Tenon-Zysten und Endophtalmitiden, die noch Monate bis Jahre nach dem Eingriff auftreten können [69].

Trabekulotomie/Gonitomie Diese Verfahren dienen der Behandlung des infantilen und kongenitalen Glaukoms. Bei der Goniotomie (nach Barkan) wird unter goniskopischer Kontrolle die Vorderkammer quer penetriert und das Trabekelwerk bis zum Schlemm´schen Kanal über 120 Grad eingeschnitten. Dieser Eingriff erfordert freie Sicht durch eine klare Hornhaut und muss nicht selten 2-3 Mal wiederholt werden. Bei der Trabekulotomie geht man den Kammerwinkel von außen an, indem man nach Präparation einer Skleralamelle den Schlemm´schen Kanal aufsucht, ein22

schneidet und mit einem Trabekulotom sondiert. Durch Einschwenken des Trabekulotoms in die Vorderkammer wird der Kanal, das davor liegende Trabekelwerk und embryonales Gewebe eingerissen und das Kammerwasser kann abfließen. Die Trabekulotomie hat eine höhere Erfolgsrate als die Goniotomie und ist auch bei trüber Hornhaut durchführbar. Da es im Verlauf immer wieder zu Rezidiven kommen kann bzw. zum narbigen Verschluss der inneren Fistel, müssen sich die Kinder häufig augenärztlichen Kontrollen unterziehen [71].

Nicht-fistulierende Operationen Bei diesen Operationsverfahren wird der Augapfel nicht eröffnet, man spricht auch von nichtperforierenden oder nicht-filtrierenden Operationen.

Tiefe Skerektomie und Viskokanalostomie Der Einsatz dieser Verfahren ist gestiegen, da ihre unmittelbaren postoperativen Komplikationen niedriger sein sollen als die der perforierenden Operationen. Bei der tiefen Sklerektomie entfernt man unter einem relativ großen Skleradeckel eine tiefe Skleralamelle, eröffnet den Schlemm´schen Kanal und entfernt dessen Außenwand, die Innenwand bleibt bestehen und das Kammerwasser kann kontinuierlich in einen sub-skleralen See abfließen und macht ein konjunktivales Filterkissen, wie bei den fistulierenden Techniken, überflüssig. Hierdurch wird auch ein überschießendes Abfließen des Kammerwassers vermieden. Das Verfahren empfiehlt sich besonders bei Patienten mit dem Risiko überschießender postoperativer Bindehautvernarbung. Bei der Viskokanalostomie (nach Stegmann) wird der präparierte Schlemm´sche Kanal noch zusätzlich mit Hyaluronsäure aufgeweitet, dies soll den natürlichen Abflussweg wieder vereinfachen. Wie erwähnt haben diese Verfahren zwar eine geringere postoperative Komplikationsrate, jedoch senken sie den Augeninnendruck nicht so effektiv wie die filtrierende Trabekulektomie. Es werden häufig mehr Medikamente noch postoperativ benötigt und ein nicht unwesentlicher Teil der Patienten bedarf im Verlauf doch einer Eröffnung der Innenwand des Schlemm´schen Kanals mittels Nd:YAG-Laser-Goniopunktur, wodurch die Sklerektomie/Viskokanalostomie schließlich doch in einen Filtrationseingriff umgewandelt wird.

23

Iridektomie Hierbei wird ein Teil der Iris entfernt, so dass das Kammerwasser leichter von der Hinter- in die Vorderkammer zirkulieren und ein möglicher Pupillarblock umgangen bzw. verhindert werden kann. Indikationen für diesen Eingriff sind somit der akute Glaukomanfall und das chronische Engwinkelglaukom.

1.5

Mitomycin C

Abb. 1: Strukturformel von Mitomycin C [122].

Mitomycin, erstmalig von Hata et al. 1954 aus Streptomyces caspitosus isoliert [53], ist ein Antibiotikum mit ausgeprägten antiproliferativen Eigenschaften. Von den drei Isoformen ist nur das Mitomycin C (MMC) für den klinischen Gebrauch geeignet. Durch intrazelluläre Metabolisierung entwickelt das Molekül alkylierende Eigenschaften und hemmt die DNASynthese durch Bindung an Guaninreste was schließlich zur Apoptose der Zelle führt [23, 122]. Dieser Effekt ist nicht spezifisch für eine bestimmte Zellzyklusphase. MMC findet aufgrund seiner antiproliferativen Eigenschaften Anwendung in der Onkologie zur Behandlung solider Tumore wie z.B. des Blasenkarzinoms, Mamma-Ca oder gastrointestinaler Tumore. In der Augenheilkunde wird es neben der Trabekulektomie auch zur Behandlung des Pterygium eingesetzt. Das Nebenwirkungsprofil bei i.v. Gabe unterscheidet sich nicht von anderen alkylierenden Zytostatika und umfasst Myelotoxizität, Haarausfall, Kanzerogenität, Teratogenität, Hepatopathie und Stomatitis. 24

Chen et al. beschrieben Ende der 1980er Jahre zuerst den Einsatz von MMC als intraoperative Ergänzung zur Trabekulektomie [19]. Der zunehmende Gebrauch von Mitomycin C bei der chirurgischen Intervention des Glaukoms hat zur Folge, dass häufiger erfolgreich der fistulierende Kammerwasserabfluss aufrechterhalten werden kann. Eine Modulation der Wundheilungsreaktion ist hierfür ursächlich. Das Scheitern einer Trabekulektomie bzw. eine funktionsloses Filterkissen ist in der Regel auf subkonjunktivale Fibrosierung zurückzuführen. Die Vernarbung als überschießende Wundheilungsreaktion wird durch aktivierte, proliferierende Fibroblasten vermittelt, die vermehrt Kollagen und Elastin bilden, in Myofibroblasten transformieren und schließlich kondensieren [70]. Khaw et al. [63, 64] und Jampel [59] zeigten in ihren Versuchen den spezifischen und

langandauernden antiproliferativen Effekt von MMC auf humane Tenonfibroblasten. Crowstone et al. konnten nachweisen, dass Apoptose durch Mitomycin C in Tenonfibroblasten eingeleitet wird [23]. Als Indikation für den Einsatz von Antimetaboliten im Allgemeinen und für Mitomycin C als Zytostatikum im Speziellen gelten für die postoperative Wundheilung prognostisch ungünstige Faktoren, die eine subkonjunktivale Fibrosierung und somit ein Fehlschlagen der Filtrations-Operation begünstigen. Solche Risikofaktoren sind z.B.: Bindehaut- oder Skleraveränderungen durch Voroperationen oder Systemerkrankungen (Sjögren-Syndrom), Uveitis, Komplikationen des filtrierenden Eingriffs (Blutung, Ausmaß des Traumas), junges Alter des Patienten, schwarze Hautfarbe, jahrelange antiglaukomatöse Lokaltherapie, entzündliches oder Neovaskularisationsglaukom u.v.m. [62, 69, 77, 80]. Der Gebrauch von Antimetaboliten, auch bei Eingriffen ohne erhöhtes Risiko, ist zunehmend weit verbreitet [69]. Die Anwendung von Mitomycin C ist nicht völlig einheitlich und ist von Operateur zu Operateur verschieden, so dass bis heute kein Standard zur Applikationsart, Ort, Dauer oder MMCKonzentration existiert. Nach Präparation des Bindehautlappens gibt es verschiedene Vorgehensweisen, MMC mittels eines Tupfers oder Schwamms aufzubringen. Manche Operateure legen ihn auf die Sklera im Bereich der späteren Skleralamelle, andere sehen es als sinnvoll an den Tupfer auf die Tenon-Kapsel der umgeschlagenen Bindehaut zu legen; keine Methode scheint der anderen überlegen zu sein [69]. Darüber hinaus gab es im Laufe der Jahre eine große Bandbreite an Variationen der MMC-Konzentration und Einwirkzeit mit dem Ziel eines höheren Nutzen-Risikoverhältnisses. In der Regel werden Konzentrationen von 0,2-0,5mg/ml und Einwirkzeiten von 2-5 Minuten gewählt [77, 100]. 25

Die Ergebnisse der Trabekulektomie mit intraoperativer Mitomycin-Anwendung sind überzeugend, wie in mehreren Studien gezeigt werden konnte [11, 62, 77]. In der Cochrane Metaanalyse-Studie von 2010 wurde bestätigt, dass unter dem Einsatz von MMC der IOD langfristig, signifikant gesenkt wird und das relative Risiko für das Fehlschlagen der Trabekulektomie sowohl in Augen mit hohem Misserfolgsrisiko als auch in Augen ohne dieses Risiko gesenkt wird [130]. Die Studien zum Outcome nach MMC-Behandlung sind vielzählig und uneinheitlich, so wird von Erfolgsraten in der Regel zwischen knapp 70% bis über 90% berichtet [69, 70, 77]. Durch die Wundheilungsmodulation und dem damit verbundenen antiproliferativen Effekt auf die Fibroblasten entstehen histologische Unterschiede des Filterkissens nach Mitomycin CBehandlung im Vergleich zu Filterkissen ohne intraoperative MMC-Gabe. Bei MMCbehandelten Filterkissen erscheint das Oberflächenepithel irregulär, das Subepithelium ist dünnwandig, weitgehend zellfrei und avaskulär mit lose geordnetem Bindegewebe. Bei normalen, MMC-freien Filterkissen, findet man dickeres Gewebe mit mehr Fibroblasten, einer physiologischen Vaskularisierung und mehr Kollagen [6, 31, 47, 83]. Dieser Beschreibung folgend wurde in einzelnen Studien eine erhöhte Inzidenz von Filterkissenleckagen nach Behandlung mit MMC beschrieben. Aus diesem erhöhten Kammerwasserabfluss ergeben sich tiefe Hypotonien der Augen, Vorderkammerabflachungen und etwaige Aderhautabhebungen [5, 6, 11, 31, 36, 47, 62, 83]. Andere Autoren sehen in einer verminderten Kammerwasserproduktion, wegen eines toxischen Effekts des MMC auf die Epithelzellen des Ziliarkörpers den Grund für die Hypotonie [82]. Daneben werden häufiger Entzündungen des Filterkissens oder gar Endophtalmitiden (unter 1% der Fälle) als Komplikationen genannt [46, 62, 88, 108]. In einer Metaanalyse der Cochrane Collaboration konnte mit geringem Evidenzgrad gezeigt werden, dass es im Vergleich zur Kontrolle unter MMC nicht zu mehr Komplikationen kommt, die das Augenlicht bedrohen. Endophtalmitiden und Infektionen konnten bei zu kleiner Studienlage und zu kurzem Studienzeitraum ebenfalls nicht mit einer höheren Inzidenz nachgewiesen werden [130]. Die enge Kontrolle der Patienten nach Behandlung bleibt somit stets nötig um frühzeitig intervenieren zu können [5]. Der vorsichtige Einsatz und die fortwährende Verbesserung der Applikationstechniken von MMC helfen dabei mögliche Komplikationen gering zu halten.

26

1.6

Viskoelastika

1.6.1 Hyaluronsäure

Abb. 2: Strukturformel der Hyaluronsäure [3].

Hyaluronsäure (HA) ist ein lineares Polymer aus N-Acetyl-D-Glucosamin-D-GlucoronsäureDisacchariden und kann extreme Längen mit einem Molekulargewicht von 103-104 kDa erreichen. Das Polysaccharid gehört zu der Gruppe der Glykosaminoglykane (GAG) und kommt ubiquitär im Körper vor und bildet vornehmlich als Proteoglykan vorliegend die Extrazellulärmatrix oder kommt in der Synovialflüssigkeit vor. Erstmalig entdeckt wurde es 1934 in der Glaskörperflüssigkeit des Auges durch Meyer und Palmer [81]. Die Hyaluronsäure kommt nicht nur im menschlichen Körper in praktisch allen Geweben vor, sondern ist auch aus evolutionstheoretischer Sicht in der Natur hoch konserviert und findet sich in vielen verschiedenen Tierarten aber auch in Bakterien wie z.B. Streptokokkenstämmen, die zur industrietechnologischen Produktion genutzt werden. HA wird in der Zelle direkt an der Plasmamembran von verschiedenen Synthasen (HAS) produziert und von dort unverändert ausgeschleust. Die Degradation der Hyaluronsäure erfolgt hauptsächlich durch mehrere HyaluronidaseIsoenzyme. Durch die Isoenzyme der Synthese und durch Degradation entstehen viele verschiedene Kettenlängen der Hyaluronsäure. Physikochemische Eigenschaften Nicht nur die Größe des Moleküls, sondern auch die hygroskopischen Eigenschaften der Hyaluronsäure befähigen es in vielen biologischen Funktionen mitzuwirken. Die osmotische Wirkung spielt z.B. eine Rolle in der Embryogenese oder bei der Gewebsschwellung im Rahmen der inflammatorischen Phase der Wundheilung, welche bei vermehrter Hyaluronsäurefreiset27

zung durch Wasserbindung auftritt. Eine gesteigerte Gewebshydrierung senkt auch die ZellZell oder Zell-Substrat-Adhäsion und erlaubt so die Ablösung, Migration und Zellteilung. Die Viskoelastizität der Hyaluronsäure ist relevant für die stoßdämpfende und befeuchtende Wirkung im Auge oder auch der Synovialflüssigkeit. Für die Ophtalmochirurgie wird diese Fähigkeit seit den frühen 1980er Jahren vielfältig ausgenutzt, allen voran in der Kataraktchirurgie, aber auch in der Keratoplastik oder Trabekulektomie [7, 44, 29]. Darüber hinaus dient die Hyaluronsäure als Barriere für größere Moleküle, Proteine oder auch Viren und Bakterien, besitzt antioxidative Eigenschaften und kann freie Radikale fangen [18].

Biologische Eigenschaften Die Hyaluronsäure vermittelt über extrazelluläre und zelluläre Rezeptoren seine Funktion auf drei Wegen: 1. über HA-Rezeptoren an der Zelloberfläche in einem autokrinen Sinn, 2. durch Interaktion mit einer Vielzahl von Extrazellularmatrix-Molekülen in einem parakrinen Sinn und als Gerüst zum Gewebsaufbau und 3. durch Interaktion mit diversen HA-Rezeptoren an verschiedenen Zelloberflächen [43]. Die Hauptgruppen an Zelloberflächenrezeptoren, an die HA bindet sind CD44, RHAMM und ICAM-1. CD44-HA-Interaktion wird mit vielen unterschiedlichen physiologischen Ereignissen wie Zell-Zell und Zell-Substrat-Adhäsion, Zellmigration, Proliferation und Zellaktivierung in Verbindung gebracht. Der RHAMM (Rezeptor for Hyaluronan Mediated Motion) löst nach HA-Bindung verschiedene Signalkaskaden aus, die v.a. in die Zellproliferation und Zellmotilität eingreifen. ICAM-1 (IntraCellular Adhesion Molecule-1) internalisiert nach Bindung die Hyaluronsäure und ist maßgeblich an ihrer Metabolisierung beteiligt. Die Eigenschaft der Hyaluronsäure im Rahmen der Synthese und der Degradation unterschiedliche Längen mit entsprechendem Molekulargewicht annehmen zu können, spielt eine große Rolle, da die HA je nach Größe eine andere Funktion erfüllt. Eine überwältigende Vielzahl an Studien deckte die mannigfaltigen Effekte der Hyaluronsäure und ihrer Fragmente auf. Die diversen hoch- und niedermolekularen Hyaluronsäuren haben mannigfaltige und zum Teil auch entgegengesetzte Effekte auf alle möglichen Zelllinien und beeinflussen viele biologische Prozesse wie Embryogenese, Tumorwachstum, Angiogenese, Zellmigration- und adhäsion sowie Wundheilung und Inflammation [2, 119, 43, 3, 18].

28

Wundheilung und klinischer Einsatz Es konnte gezeigt werden, dass die Hyaluronsäure eine wichtige Rolle in der Wundheilungsregulation spielt und, dass die Applikation von HA in Wunden zu schnellerer und narbenloser Wundheilung führt [73, 129]. Eine narbenlose Wundheilung soll mit einer verlängerten Präsenz von HA in der Wunde assoziiert sein. Die Hyaluronsäure soll die Kollagensynthese und die sog. Matrixzellen hemmen können, die für die Vernarbung verantwortlich gemacht werden [18]. Daraus ergibt sich die Möglichkeit, mit Hilfe der Hyaluronsäure die Zellentwicklung und damit die Wundbeschaffenheit bzw. die Gewebsstruktur günstig zu beeinflussen. Dies macht sie vor allem für den Einsatz in vielen Bereichen der operativen Medizin attraktiv wie z.B. bei Wundheilungsstörungen [27], in der Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde bei Trommelfelldefekten oder Stimmbandschäden [20, 73], zur Behandlung der Osteoarthritis oder in der Viszeralchirurgie und Gynäkologie zur Verhinderung postoperativer, peritonealer Adhäsionen [21, 103]. In der Ophtalmochirurgie ist die Hyaluronsäure zur Aufrechterhaltung der Vorderkammer bei der Katarakt-Operation wegen ihrer physikochemischen Eigenschaften bereits seit langem etabliert [7, 29 44, 54, 55]. Deswegen und wegen ihrer wundheilenden Wirkung wurde der Einsatz der Hyaluronsäure im Rahmen von Studien auch auf andere Felder der Ophtalomchirurgie, wie der Keratoplastik, der vitreoretinalen Chirurgie sowie der fistulierenden und nicht fistulierenden Glaukomchirurgie, ausgeweitet. Bei der Trabekulektomie verspricht man sich - in Hinblick auf die postoperativen Komplikationen z.B. nach Mitomycin CBehandlung, wie z.B. Dünnwandigkeit und Leckage des Filterkissens, Vorderkammerabflachung und Hypotonie - sowohl mechanische Unterstützung als auch Reduzierung eines Filterkissendefekts. Durch die intra- oder postoperative Applikation von HA in die Vorderkammer oder direkt subkonjunktival in das neu geschaffene Filterkissen soll ein stabilisierender Effekt und die Modulation der Wundheilung des Filterkissens hervorgerufen werden. Die Durchführung und Ergebnisse der klinischen Studien blieben jedoch bisher uneinheitlich [50, 54, 55, 78].

Drug delivery Die der Hyaluronsäure inhärente Biokompatibilität macht sie besonders geeignet sie bei exogener Applikation als Vehikel für Medikamente, aber auch DNS und anderen Agentien zu nutzen [3, 72]. Gerade in Bereichen wo Medikamente für einen bestimmten Zeitraum und nur lokal am Ort ihrer Applikation mit der höchsten Konzentration wirken und nicht schnell weg29

diffundieren sollen, ist der Einsatz von viskoelastischen Gelen und allen voran Hyaluronsäure vielversprechend [2, 3, 43]. Durch chemische Modifikation der HA und Kopplung mit Medikamenten, aber auch durch deren einfache Mischung wurde schon in vielen Bereichen der Effekt der kontrollierten Medikamentenfreisetzung gezeigt, wie z.B. bei nasaler, dermaler oder pulmonaler Applikation [14, 74]. Durch an HA gekoppeltes Mitomycin C konnte im Tiermodell ebenfalls eine geringere postoperative Adhäsionslast nachgewiesen werden [75]. Am Auge topisch angewandte Medikamente haben nur eine geringe Bioverfügbarkeit, in vielen Untersuchungen konnte aber gezeigt werden, dass diese durch die Kombination mit HA verbessert wird und das Medikament (z.B. Pilocarpin) länger präkorneal im Auge verbleibt [74]. Auch bei der intraokulären Applikation von Gentamicin wurde dessen Wirkung durch Kombination mit HA im Tierexperiment verbessert [86, 87]. Die spezielle Freisetzungskinetik von Kortikosteroiden aus einem Hyaluronsäuregel kann ebenfalls für die Glaukomchirurgie von Vorteil sein [117].

1.6.2 Hyaluronidasen

Die Hyaluronidasen sind eine im gesamten Tierreich vorkommende Gruppe von Enzymen, die EZM-Bestandteile wie Mukopolysaccharide vom Hyaluronsäuretyp, durch Hydrolyse spalten. Man kann die Hyaluronidasen biochemisch, nach Vorkommen und Spaltprodukt in drei Gruppen unterteilen: (1) der Testis-Typ kommt bei vielen verschieden Tieren vor, z.B. in deren Spermatozoen oder auch in den Lysosomen von Schlangengift, und spaltet die Hyaluoronsäure oder auch Chondroitin in Tetra- oder Hexasaccharide, (2) eine weitere Gruppe findet sich im Blutegel, und schließlich (3) die mikrobielle Hyaluronidase, welche als Virulenzfaktor dient und z.B. von Bakterien produziert wird, um leichter Gewebe penetrieren zu können. Sie spaltet die HA in ungesättigte Oligosaccharide [43]. Die Hyaluronidasen umfassen mehrere Isoenzyme, die je nach Gewebe, in unterschiedlichem Umfang vorhanden sind. Durch die Spaltung der Hyaluronsäure entstehen Oligosaccharide, wodurch die Viskosität der HA enorm reduziert und ihre o.g. physikochemische Eigenschaft verändert wird. Hinzu kommt, dass durch die Tetra- und Hexasaccharide andere und z.T. auch der hochmolekularen HA entgegengesetzte biologische Effekte ausgelöst werden, die vor allem das Zellproliferationsverhalten beeinflussen [43, 118, 119]. 30

Durch die Enzymwirkung wird die Extrazellularmatrix durchlässiger, die Viskosität nimmt ab und die Permeabilität des Bindegewebes nimmt zu. Flüssigkeiten können so schneller abfließen und die Resorptionsrate nach z.B. subkutaner oder intramuskulärer Injektion nimmt zu, die Hyaluronidase wird deshalb auch als Diffusionsfaktor (Englisch: spreading factor) bezeichnet. Die in der Klinik eingesetzte Hyaluronidase wird aus Stierhoden gewonnen und dient mehreren therapeutischen Zwecken. So wird ihr absorptionsfördernder Effekt in der Lokalanästhesie genutzt um deren Wirkung zu beschleunigen und auszuweiten, oder es wird die Gewebszerstörung durch Paravasate bei i.v.-Gabe von Chemotherapeutika, Antibiotika etc. reduziert. In der Ophtalmochirurgie wird das Enzym nicht nur in Kombination mit der Lokalanästhesie genutzt, sondern dient auch der Augendrucksenkung, die postoperativ nach Applikation von Hyaluronsäure in die Vorderkammer oder subkonjunktival auftreten kann, indem es den Abfluss wieder verbessert. Das Medikament wird peri- oder retobulbär oder in die Sub-Tenonschicht injiziert. Hyaluronidase wurde als Additivum zu Chemotherapeutika untersucht und soll deren Wirkung verstärken bzw. soll sogar eigene krebshemmende Eigenschaften besitzen [43].

31

1.6.3 Hydroxypropylmethylcellulose (HPMC)

Abb. 3: Strukturformel der Hydroxypropylmethylcellulose [http://www.sigmaaldrich.com/thumb/structureimages/60/mfcd00131360.gif, 19.12.2010].

Die Hydroxypropylmethylcellulose (HPMC) ist ein Gemisch aus verschiedenen Methylcellulosen und existiert in verschiedenen Polymerisationsgraden auf dem Markt. Die Methylcellulose kommt weit verbreitet in Pflanzen vor und findet vielfältige Anwendung in der Industrie aber auch Pharmazie und Medizin. Die HPMC zählt zu den niedrigviskösen, dispersiven (sich ausbreitenden), hydrophilen Gelen. Diese Eigenschaften werden durch künstliche Variation der Kettenlänge und damit des Molekulargewichts verändert. Durch den introkulären Gebrauch dient die HPMC dem Schutz des Gewebes, der Aufrechterhaltung der Vorderkammer oder der Verhinderung von Synechien und wird v.a. zur Beschichtung der IOL vor Implantation im Rahmen der Kataraktoperation genutzt [29]. Als Grundlage für Augentropfen soll es bei präkornealer Anwendung die Hornhaut langfristig befeuchten. Als Nebenwirkung bei intraokularer Gabe kann, wie bei allen Viskoelastika, der Augeninnendruck kurzfristig steigen [126]. Im Rahmen der Kataraktoperation konnte aber gezeigt werden, dass die HPMC vergleichbare oder gar bessere postoperative Ergebnisse erzeugt als z.B. Hyaluronsäure [99]. Die Datenlage bei Anwendung von HPMC im Rahmen der Trabekulektomie ist sehr gering. In einem Tiermodell konnte klinisch und histologisch gezeigt werden, dass die Erfolgsrate an funktionierenden Filterkissen durch den Einsatz von Methylcellulosegelen in die Vorderkammer und subkunjuntival gesteigert werden kann. Zusätzlich wurde ein die Wundheilung hemmender Effekt vermutet, der den IOD senken helfen soll [110]. Darüber hinaus gibt es auch Hinweise dafür, dass das HPMC-Gel, ähnlich der Hyaluronsäure, die Fähigkeit besitzt, als sog. drug-delivery-device dienen zu können und so Wirkort und Dauer eines Medikaments und dessen Kinetik therapeutisch zu verändern [13]. 32

1.7

Apoptose

Im Mittelpunkt der Wundheilung nach Trabekulektomie stehen die Fibroblasten der Tenonkapsel. Sie proliferieren und bilden die Extrazellularmatrix, was bei überschießender Reaktion zur Vernarbung und somit zum Verlust der augendrucksenkenden Wirkung des Filterkissens führt. Die Regulation des Proliferationsverhaltens der Fibroblasten spielt daher eine entscheidende Rolle, um die Wundheilung und Therapieergebnisse zu verbessern. Durch den Einsatz von Agenzien, wie Mitomycin C, in der Ophtalmochirurgie wird u.a. die Apoptose eingeleitet. Die Apoptose ist ein aktiver Prozess der Zellzerstörung und benötigt die Regulation vieler verschiedener Enzyme und Gene, die in einer Kaskade aktiviert werden. Das Gleichgewicht in multizellulären Organismen wird nicht nur durch die Zellproliferation und Zelldifferenzierung reguliert, sondern auch durch den Zelltod. Vom Zelltod durch aktive Apoptose wird der passive Zelltod durch Nekrose unterschieden, bei dem durch Freisetzung von immunogenen Zellbestandteilen eine Entzündungsreaktion provoziert wird. Apoptose kann auf zwei unterschiedlichen Wegen aktiviert werden kann. Man spricht von extrinsischer/Typ I und intrinsischer/Typ II Apoptoseinduktion. Die extrinsische Induktion wird über sog. Todesrezeptoren, die zur Gruppe der TNF/NGFRezeptor-Familie gehören und ihren korrespondierenden Liganden, die man zur TNF-Familie von membranständigen Cytokinen zählt, vermittelt. Der Fokus bisheriger Untersuchungen lag auf der Interaktion zwischen CD95 (APO-1 oder Fas) und seinem Liganden CD95L (Fas-L), an denen gezeigt wurde, dass bei Aktivierung die cytosolischen Enden des Rezeptors über sog. Todesdomänen andere Adapterproteine (FADD bzw. TRADD) binden – der sog. DISC (death-inducing signalling complex) entsteht. An ihm erfolgt die Spaltung der pro-Caspase-8 zu Capsase-8, durch die eine Proteasekaskade eingeleitet wird, in der aktivierte Caspasen eine Abfolge von nachgeschalteten Caspasen spalten und aktivieren. An deren Ende steht u.a. die Caspase-3-vermittelte Aktivierung einer DNSase, die in den Zellkern gelangt und die DNS fragmentiert [134]. Durch Caspase-8-vermittelte Aktivierung von Bid wird die Porenbildung der mitochondrialen Membran mittels Bax gebahnt, die Membran wird undicht und im Verlauf erfolgt der Zusammenbruch des Membranpotentials. Cytochrom C u.a. wird freigesetzt, wodurch wiederum Caspase-9 aktiviert und eine weitere Caspasekaskade bis Caspase-3 gestartet wird. 33

Über jenen letztgenannten mitochondrialen Weg kann die Apoptose auch alleine, ohne Rezeptorbindung erfolgen, man spricht von intrinsischer Induktion. Durch einen DNS-Defekt, z.B. durch Chemotherapuetika oder Strahlung und anderen Zellstress ausgelöst, bricht das mitochondriale Membranpotential zusammen und erst in dessen Folge wird die Caspasekaskade aktiviert [105]. Es wird also wenig DISC-Bildung und Caspase-8 benötigt und der Membranpotentialzusammenbruch steht hier vor der Caspasekaskade, die vornehmlich über Caspase-9 bzw. das sog. Apoptosom eingeleitet wird.

Abb. 4: CD95-Signalweg. FasL-Bindung an CD95 resultiert in DISC-Bildung und Freisetzung von Caspase-8. C-FLIP hemmt die Caspase 8-Bildung an DISC. Der Typ I-Weg führt mittels CD95 und DISC zu einer starken Caspase-8-Aktivierung und anderer Caspasen und letztlich Caspase-3 und diese zur Apoptose. Über den Typ IIWeg wird nur eine kleine Mege an DISC gebildet, das in mitochondrialer Aktivierung und Freisetzung proapoptotischer Faktoren wie Cytochrom C resultiert. Das aktive Apoptosom wird im Cytosol gebildet und initiiert eine Caspase-Kaskade [105].

Die Apoptose unterliegt einer strengen Regulation und kann, neben anderen, sowohl auf der CD95/DISC-Ebene als auch auf der mitochondrialen Ebene reguliert werden. Die Aktivierung 34

von Caspase-8 am DISC kann z.B. durch sog. FLIP (FLICE inhibitory proteins) gehemmt werden. Die Bcl-2 Proteinfamilie reguliert weitere Bereiche der Signaltransduktion und kann in eine anti-apoptotische (Bcl-2 und Bcl-xL) und eine apoptotische Gruppe (z.B. Bax und Bak) eingeteilt werden. Bax und Bak sind hauptverantwortlich für die Porenbildung in die mitochondriale Membran und somit Schlüsselenzyme im intrinsischen Apoptoseweg. Ihre Aktivität wird durch Bcl-2 und Bcl-xL gehemmt. Dieser Einfluss fällt weg, wenn diese wiederum weniger exprimiert bzw. gehemmt werden, was z.B. indirekt durch p53 bei DNSSchäden oder, wie oben erwähnt, durch Caspase-8 Rezeptor vermittelt passieren kann. Das Verhältnis zwischen den beiden Bcl-2-Gruppen spielt also eine große Rolle bei der Entscheidung ob Apoptose stattfindet [105]. Bcl-2 ist somit nicht direkt proliferativ wirksam, wie es von einem Onkogen vermutet wird, sondern verhindert vielmehr den Zelltod. Die folgende Graphik zeigt eine Übersicht über die verschiedenen Signalwege und ihre Regulation.

35

Abb. 5: Übersicht über Apoptose-hemmende und Apoptose-auslösende Faktoren und Kaskaden. In Blau: antiapoptotische Signale wie Moleküle der Extrazellularmatrix oder Rezeptoren für sog. survival factors oder Chemokine. In schwarzen Kästen: proapoptotische Signale wie Zellstress-vermittelte DNS-Schäden [95].

36

1.8

Fragestellung

Das Glaukom ist eine in den meisten Fällen langsam fortschreitende, das Augenlicht bedrohende Erkrankung mit einer hohen Prävalenz und daher auch großem volkswirtschaftlichen Schaden. Nach Diabetes mellitus ist es die häufigste Erblindungsursache weltweit. Die Senkung des intraokulären Drucks steht im Mittelpunkt der Therapie und wird neben der antiglaukomatösen, konservativen Behandlung durch operative Verfahren erreicht. Von besonderer Bedeutung ist hier die etablierte Trabekulektomie als sog. fistulierendes Verfahren, um den IOD wirkungsvoll zu senken. Häufige Komplikationen bzw. das Fehlschlagen der Oeration sind auf eine überschießende, durch Fibroblasten der skleralen Tenonkapsel vermittelte Narbenbildung zurückzuführen, die den künstlich geschaffenen Kammerwasserabfluss wieder verschließt und einen hohen IOD aufrecht erhalten. Durch den intraoperativen Einsatz von sog. Antifibrotika wie 5-FU und MMC konnte die Erfolgsquote der Trabekulektomie erhöht werden. Jedoch entstehen dadurch weitere Komplikationen wie Schädigung der Sklerazellen oder des Ziliarkörpers, Wundleckage, Hypotonie, Vorderkammerabflachung, Wundentzündung oder Endophtalmitiden, die wiederum eine Bedrohung für das Augenlicht darstellen können. Deshalb wird stets nach Verbesserungen der chirurgischen Verfahren aber auch der Art und Applikation von Medikamenten gesucht, welche die Wundheilung günstig modulieren. In dieser Arbeit wird das Proliferationsverhalten von humanen Tenonfibroblasten untersucht, die u.a. im Mittelpunkt der Wundheilung und Fibrosierung des Filterkissens nach Trabekulektomie stehen. Unter der Einwirkung von Viskoelastika wie Hyaluronsäure mit/ohne Hyaluronidase, Hypromellose und von Mitomycin C in verschiedenen Kombinationen und Konzentrationen wird ihr Wachstum beobachtet um daraus etwaige Effekte der Substanzen und Substanzkombinationen herleiten zu können. In diesem explorativen Ansatz werden die Medikamente verwendet, die für die ophtalmochirurgische Anwendung bei genannter Indikation zugelassen sind, um zum einen klinische Bedingungen besser simulieren zu können und zum anderen mögliche, neue Therapieoptionen leichter klinisch implementieren zu können. Folgenden Fragen soll in der vorliegenden Arbeit nachgegangen werden:

37

1. Wird die Zellproliferation der Tenonfibroblasten durch die Substanzen beeinflusst? Haben die Viskoelastika einen proliferativen oder antiproliferativen/zytostatischen Effekt? 2. Wird die Wirkung von MMC auf die Fibroblasten durch die Viskoelastika beeinflusst? Wird der antiproliferative Effekt verstärkt, was z.B. im Sinne eines drug-delivery oder durch eine dem Gel inhärente antiproliferative Wirkung denkbar wäre? Wird der antiproliferative Effekt verringert, was z.B. durch eine Barrierefunktion des Gels oder durch eine dem Gel inhärente proliferative Wirkung möglich wäre? 3. Kann molekularbiologisch gezeigt werden, auf welchem Weg die Substanzen das Proliferationsverhalten bzw. die Apoptose der Fibroblasten beeinflussen? 4. Kann aus den Ergebnissen abgeleitet werden, ob eine Kombination und wenn ja welche Kombination der Substanzen sich für weitere Untersuchungen und etwaige klinische Anwendung anbieten und welche eher nicht?

38

2

Material und Methoden

2.1

Humane Tenonfibroblasten

Zelltyp:

Tenon-Fibroblasten von verschiedenen Patienten unterschiedlichen Alters aus der Universitätsaugenklinik zu Köln

Das humane Tenongewebe wurde aus den Augen von Patienten im Rahmen von Vorderabschnittoperationen unterschiedlicher Indikation gewonnen. Jeder einzelne Patient gab vor dem Eingriff eine Einwilligungserklärung zur Verwendung des ihm entnommenen Materials für Versuche in der Glaukomforschung ab. Da die in den Versuchen benutzten Zellen humanen Ursprungs waren, können die in dieser Arbeit erhobenen Ergebnisse möglicherweise nicht nur in der Augenheilkunde, sondern auch – nach gründlicher Prüfung – in andere klinische Fachgebiete übertragen werden.

2.2

Zellkultur, Subkultivierung

Material: - Kulturmedium (DMEM, Dulbecco’s Mod Eagle Medium, 500 ml, 1000 mg Glucose), (InVitrogen) - FCS Gold (fetales Kälberserum, 500ml), (PAA) - Penicillin/Streptomycin, lyophillisert, 10.000 IE/ml / 10.000 μg/ml, in 5 ml sterilem aqua dest. rekonstituiert, (Biochrom AG) - Amphotericin B, 50 mg, (X-Gen Pharmaceuticals) - PBS (phosphate-buffered saline, pH=7,3; 8,0g/l NaCl; 1,15g/l Na2HPO4; 0,2g/l KH2PO4; 0,2g/l KCl), (PAA) - Trypsin/EDTA (0,25% Trypsin, 1mM EDTA), (Gibco-Invitrogen) - Dimethylsulphoxide (DMSO), 10 ml (Sigma) - Sterile Arbeitsbank (Köttermann, 8580) - Brutschrank (Binder, CB-150 CO2-Inkubator) - Phasenkontrastmikroskpop (MC63, Zeiss) 39

- Zentrifuge (Heraeus, Megafuge 1.0) - Pipettierhilfe: accu-jet (Brand, Eppendorf research) - Serologische Pipetten (Sarstedt) - Zellkulturschalen: Petri Dish 100 mm2 SQPS, (Sarstedt) - Zellkulturflaschen: Nunclon Surface, (Nunc) - 50ml Falcon-Tubes - 10ml Falcon-Tubes - Neubauer Zählkammer, 0,1 mm Tiefe, 0,0025mm2, (Optik Labor)

Methode:

Die Kultivierung der humanen Tenonfibroblasten erfolgte nach den etablierten allgemeinen und speziellen Methoden. Die optimale Kulturbedingung wurden erreicht in einem Kulturmedium mit 10% fetalem Kälberserum, Amphotericin B [2,5 μg/ml] und Penicillin/Streptomycin [100 IE/ml / 100μg/ml] in einer wassergesättigten Atmosphäre von 5% CO2 und 37ºC. Zur Anzucht der Fibroblasten wurde das aus den Operationen gewonnene Tenongewebe zeitnah in eine kleine Petrischale mit 2 ml Medium gegeben und im Brutschrank inkubiert. Nach wenigen Tagen war das Gewebe an die Schale angeheftet und nach ca. einer Woche konnten erste Zellausläufer mikroskopisch nachgewiesen werden. Wenn dies der Fall war, konnte das Gewebestück mit einem Skalpell oder einer sterilen Kanüle in eine neue Petrischale umgesetzt werden und erneut zu einem Monolayer anwachsen. War der Boden nach ca. 4 Wochen, mit zweimal wöchentlichem Mediumwechsel, konfluent mit Fibroblasten bewachsen, konnten diese subkultiviert werden. Dazu wurde das Medium mit einer Glaspipetten abgesaugt, die Zellen zweimal mit 5 ml PBS gewaschen und dann für ca. 2-3 Minuten mit 0,5 ml 0,25%Trypsin/1mM EDTA-Lösung bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Durch Zugabe von 5 ml serumhaltigem Medium wurde das Trypsin neutralisiert und die Supsension in ein Reagenzglas überführt und schließlich zentrifugiert bei 15.000 U/min für 1 Minute. Der Zellpellet wurde wiederum in 5ml Medium resuspendiert und die Zelllösung in eine kleine Kulturflasche (25cm2) überführt. Zum Erhalt und zur Weiterverarbeitung der Zellkultur waren folgende Punkte durchzuführen:

40

1. regelmäßige Kontrolle der Kultur durch das Phasenmikroskop 2. regelmäßiger Mediumwechsel 3. Passagieren 4. Einfrieren 5. Poolen

1. Unter dem Phasenmikroskop erscheinen die Tenonfibroblasten als längliche, spindelförmige Zellen ohne Zellgranula. Durch regelmäßige Kontrolle konnte die Konfluens, Zelldichte und Morphologie beobachtet werden. 2. Der Wechsel des Mediums erfolgte zweimal wöchentlich. So wurden teils toxische Stoffwechselprodukte entfernt und durch ein optimales Millieu ersetzt. 3. Zur Subkultivierung wurden die dicht gewachsenen Zellen in den 25 cm2 Kultuflaschen mit 2 ml PBS gewaschen und mit 0,5ml 0,25%Trypsin/1mM EDTALösung bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Wiederum wurde Trypsin mit 5 ml serumhaltigem Medium neutralisiert, die Lösung in einem Reagenzglas zentrifugiert und der Überstand abgesaugt. Der Zellpellet wurde in 2 ml Medium resuspendiert wovon je 1ml in eine neue Kulturflasche überführt wurde und diese je auf ein Gesamtvolumen von 4ml mit Komplettmedium aufgefüllt wurde. 4. Waren mehr Zellen vorhanden als in absehbarer Zeit weiter verarbeitet werden konnten, wurden einige Passagen eingefroren. Dazu wurde spezielles Einfriermedium bestehend aus 40% zusatzfreiem Medium, 40% fetalem Kälberserum und 20% DSMO, hergestellt und auf Eis gelegt. Die Zellen wurde wie bereits beschreiben trypsiniert und danach in kaltem Medium ohne Zusätze zweimal bei 15.000 U/min für eine Minute zentrifugiert. Der Zellpellet wurde in 500 μl serumfreien Medium aufgenommen und die Zellzahl mittels Zählkammer bestimmt. Davon wurden je 2x106 Zellen in 500μl serumfreien Medium aufgenommen und mit 500μl Einfriermedium gemischt und auf zwei Epp-Cups verteilt, so dass sich eine Zellzahl von 1x106 Zellen pro 500μl und Epp-Cup ergab. Die Röhrchen wurden über Nacht bei -80ºC gelagert und schließlich in Flüssigstickstoff bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt. Zur Wiederverwendung wurden die Zellen bei Raumtemperatur aufgetaut und wieder in eine Kulturflasche (25cm2 ) mit 5 ml Kulturmedium überführt. 5. Für die Inkubationsversuche sollten die Zellen der verschiedenen Patienten gepoolt sein, weshalb diese aufgrund der hohen Zahl in mehreren großen Kultur41

flaschen (125cm2) gemischt wurden. Dazu wurden von den unterschiedlichen Patienten die kleinen Kulturflaschen, die in der gleichen Passage waren wie unter (3.) beschrieben, trypsiniert. Die Suspension wurde in einer großen Kulturflasche gesammelt, die Zellen mittels Zählkammer gezählt und auf mehrere große Kulturflaschen verteilt, so dass 1x106 Zellen je Flasche in einem Gesamtvolumen von 20ml Medium aufgenommen wurden. Innerhalb von ca. zwei Wochen hatten die Zellen den Boden der Flasche konfluent bewachsen und konnten für die Inkubationsversuche genutzt werden.

2.3

Abläufe der Inkubationsexperimente

2.3.1 Aussähen der Zellen in 96-Well Material: - Medium (DMEM, Dulbecco’s Mod Eagle Medium, 500 ml, 1000 mg Glucose), (InVitrogen) - FCS Gold (fetales Kälberserum, 500 ml), (PAA) - Penicillin/Streptomycin, lyophillisert, 10.000 IE/ml / 10.000 μg/ml, in 5 ml sterilem aqua dest. rekonstituiert, (Biochrom AG) - Amphotericin B, 50 mg, (X-Gen Pharmaceuticals) - PBS (phosphate-buffered saline, pH=7,3; 8,0 g/l NaCl; 1,15 g/l Na2HPO4; 0,2 g/l KH2PO4; 0,2 g/l KCl), (PAA) - Trypsin/EDTA (0,25% Trypsin, 1 mM EDTA), (Gibco-Invitrogen) - Sterile Arbeitsbank (Köttermann, 8580) - Brutschrank (Binder, CB-150 CO2-Inkubator) - Phasenkontrastmikroskop (MC63, Zeiss) - Pipettierhilfe: accu-jet (Brand, Eppendorf research) - Glaspipetten (Nunc) - Serologische Pipetten (Sarstedt) - Filter Tips: Biosphere 1000 µl, 100 µl, 10 µl, (Sarstedt) - Zellkulturflaschen: Nunclon Surface, (Nunc) 42

- 50ml Falcon-Tubes - 10ml Falcon-Tubes - Neubauer Zählkammer, 0,1 mm Tiefe, 0,0025 mm2, (Optik Labor) - 96-Well-Platte: tissue culture plate 96-well, flatbottomcell+, (Sarstedt)

Methode:

Für die Inkubationsexperimente wurden ausschließlich konfluent gewachsene Fibroblasten aus gepoolten, großen Kulturflaschen (125cm2) benutzt. Die Zellen befanden sich für die Versuche in der Regel zwischen der 2. und 4. Passage. Die Kultur wurde mittels 2 ml 0,25% Trypsin/1mM EDTA-Lösung bei 37°C im Brutschrank vom Boden gelöst und danach in 20ml Medium aufgenommen, zentrifugiert und schließlich in 10 ml Medium wieder in Lösung gebracht. Aus dieser gut gemischten Zelllösung wurde mittels Zählkammer und Mikroskop die Anzahl der Zellen im Mittel bestimmt. Daraufhin wurde ein Teil der Zelllösung auf eine Konzentration von 250.000 Zellen/ml verdünnt, so dass 25.000 Zellen/well (100 μl/well) eingesät werden konnten. Zur Leerwertbestimmung wurden die wells am äußeren Rand der 96 WellPlatte mit 100µl Medium ohne Zellen befüllt (s. Abb. Schema für Versuch). Schließlich wurden die Zellen in den 96-well-Platten für 24 Stunden unter Idealbedingungen (s.o.) inkubiert und am nächsten Tag wurde das Anwachsen der Fibroblasten mikroskopisch kontrolliert. Daraufhin schlossen sich die Inkubationsversuche wie unter 2.4 und 2.5 beschrieben an.

2.3.2 Kultivierung der Zellen für Western Blot-Versuche Zur Durchführung des Western Blot wurden Proteine aus bedeutend mehr behandeleten Zellen benötigt als in den üblichen Inkubationsversuchen mit 96-Well-Platten. Deshalb wurden mehr Zellen im gleichen Maßstab in großen Petrischalen inkubiert. Auch hierzu wurden wieder konfluent gewachsene Fibroblasten aus gepoolten, 125cm2 großen, Kulturflaschen benutzt. Es wurde darauf geachtet, dass sich die Zellen zwische der 2. und 4. Passage befanden. Die Zellen wurden wie oben beschrieben vom Zellboden gelöst. Um gleiche Verhältnisse in den Petrischalen zu schaffen wie in den wells ergab sich folgende Rechnung:

43

Durchmesser

Fläche

Zellen

Volumen, Medium

Well Petrischale

0,75cm 9,0cm

0,44cm2 63,62cm

2

25.000

100μl

3.600.000

14ml

Somit wurden je vorgesehene Behandlung 3,6x106 Zellen in einer Petrischale mit ca. 64 cm2 Grundfläche in 14 ml Medium für 24 Stunden inkubiert. Waren die Zellen angewachsen folgte die Behandlung mit den Gelen und Mitomycin C.

2.3.3 Reagenzien für Inkubationsversuche Reagenzien:

- Natriumhyaluronat 5000 [10 mg/ml Phosphatpuffer, 1,0%, Mw: 4Mio Da], (Healon, Advanced Medical Optics Inc.) - Hypromellose (Methylcellulosepropylenglycerolether) [20 mg/ml, 2,0%], (AT.Viscose, Acri.Tec GmbH, Carl Zeiss Meditec) - Hyaluronidase [150 I.E.], (Hylase “Dessau” 150 I.E., Riemser Arzneimittel AG), gelöst in 2 ml 0,9% NaCl - Mitomycin C 2mg gelöst in 2 ml, (Mitomycin 2 medac, medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate)

Methode:

Nachdem die Zellen über 24 Stunden angewachsen waren, schlossen sich die Versuche mit den Behandlungskombinationen an. Dazu wurden die Gele, Hyaluronsäure (HA) und Methylcellulose, nach gewünschter Konzentration zunächst mit serumfreien Medium gemischt und gegebenenfalls mit Mitomycin C versetzt. Das alte Medium wurde von der 96-Well-Platte bzw. aus der Petrischale entfernt und die Gele und MMC wurden einzeln und in Kombination auf die Zellen pipettiert. Es ergaben sich folgende Kombinationsgruppen mit denen die Zellen behandelt wurden: 1. Kontrolle: kein MMC, kein Gel 2. Hyaluronsäure 44

3. Hyaluronsäure + Hylase 4. Hylase 5. Hypromellose Konzentration A 6. Hypromellose Konzentration B 7. MMC 8. MMC + Hyaluronsäure 9. MMC + Hyaluronsäure + Hylase 10. MMC + Hylase 11. MMC + Hypromellose Konzentration A 12. MMC + Hypromellose Konzentration B

Aus Vorversuchen wurde die geeignete Konzentration der Gele und von MMC bestimmt:

Hyaluronsäure: Bei der Hyaluronsäure musste, aufgrund der hohen Viskosität, eine hohe Verdünnung für die in vitro Versuche gewählt werden um eine Handhabung möglich zu machen und gleiche Mengenverhältnisse je Probe zu gewährleistet. Bei einer Verdünnung von 1:50 war das Gel augenscheinlich völlig in Lösung gegangen. Durch die Verwendung von Hyaluronidase wurde niedermolekulare HA künstlich hergestellt um den möglichen physiologischen Abbau zu simulieren. Es konnte eine höhere Konzentration für Hyaluronsäure gewählt werden, da hierdurch die Viskosität des Gels deutlich heruntergesetzt wird.

Hypromellose: Das Verdünnungsverhältnis der Hypromellose richtete sich nach der Hyaluronsäure um eine Vergleichbarkeit der beiden Gele anstellen zu können. Aufgrund seiner viskoelastischen Eigenschaften konnte die Methylcellulose auch in hoher Konzentration leicht mit Medium verdünnt werden und pipettiert werden.

Mitomycin C: Aus Vorversuchen wurde eine Konzentration bestimmt, bei der innerhalb des Behandlungszeitraums mit MMC mindestens 50% der Zellen absterben.

Es ergaben sich folgende Endkonzentrationen je Probe: 45

-

Hyaluronsäure [0,2 mg/ml, 0,02%], (Verdünnung 1:50)

-

Hyaluronsäure + Hylase [2,5 mg/ml, 0,25%; 19 I.E./ml], (Verdünnung 1:4)

-

Hylase [1,5 I.E./ml], (Verdünnung 1:50)

-

Methylcellulose Konzentration A [0,4 mg/ml, 0,04%], (Verdünnung 1:50)

-

Methylcellulose Konzentration B [5 mg/ml, 0,5%], (Verdünnung 1:4)

-

MMC [180 µM, 0,06 mg/ml]

46

blanc

blanc

blanc

blanc

blanc

blanc

blanc

B

C

D

E

F

G

H

blanc

4

Leerwert +MMC - MMC

blanc

MMC-Kontrolle

Methylcellulose [5mg/ml]

100% Wachstum

blanc

Hyaluronsäure [0,2mg/ml]

Kontrolle

Methylcellulose [5mg/ml]

Hyaluronsäure Methylcellulose [2,5mg/ml]+Hyaluro [0,4mg/ml] nidase [19 I.E.]

Methylcellulose [0,4mg/ml]

blanc

5

blanc

Methylcellulose [0,4mg/ml]

blanc

blanc

blanc

Hyaluronsäure [0,2mg/ml]

blanc

MMC-Kontrolle

blanc

11

Hyaluronsäure Hyaluronidase [1,5 [2,5mg/ml]+Hyaluro I.E.] nidase [19 I.E.]

blanc

10

blanc

Methylcellulose [5mg/ml]

Kontrolle

blanc

Methylcellulose [0,4mg/ml]

Methylcellulose [5mg/ml]

MMC-Kontrolle

blanc

Hyaluronsäure [2,5mg/ml]+Hyaluro nidase [19 I.E.]

Methylcellulose [0,4mg/ml]

Methylcellulose [5mg/ml]

Kontrolle

Hyaluronsäure Hyaluronidase [1,5 Hyaluronsäure [2,5mg/ml]+Hyaluro I.E.] [0,2mg/ml] nidase [19 I.E.]

Methylcellulose [0,4mg/ml]

blanc

9

Hyaluronsäure Hyaluronidase [1,5 Hyaluronsäure [2,5mg/ml]+Hyaluro I.E.] [0,2mg/ml] nidase [19 I.E.]

Methylcellulose [0,4mg/ml]

Methylcellulose [5mg/ml]

blanc

8

Hyaluronsäure Hyaluronidase [1,5 Hyaluronidase [1,5 Hyaluronsäure [2,5mg/ml]+Hyaluro I.E.] I.E.] [0,2mg/ml] nidase [19 I.E.]

Hyaluronsäure [0,2mg/ml]

Methylcellulose [5mg/ml]

Kontrolle

blanc

7

Hyaluronsäure Hyaluronidase [1,5 Hyaluronidase [1,5 Hyaluronsäure [2,5mg/ml]+Hyaluro I.E.] I.E.] [0,2mg/ml] nidase [19 I.E.]

Hyaluronsäure [0,2mg/ml]

Kontrolle

MMC-Kontrolle

Methylcellulose [5mg/ml]

blanc

6

Hyaluronsäure Hyaluronidase [1,5 Methylcellulose [2,5mg/ml]+Hyaluro I.E.] [0,4mg/ml] nidase [19 I.E.]

Hyaluronsäure [0,2mg/ml]

MMC-Kontrolle

Methylcellulose [5mg/ml]

Methylcellulose [5mg/ml]

Hyaluronsäure Hyaluronidase [1,5 Methylcellulose [2,5mg/ml]+Hyaluro I.E.] [0,4mg/ml] nidase [19 I.E.]

blanc

3

Hyaluronsäure Hyaluronidase [1,5 Methylcellulose [2,5mg/ml]+Hyaluro I.E.] [0,4mg/ml] nidase [19 I.E.]

Hyaluronsäure [0,2mg/ml]

blanc

2

25.000 Zellen/Well

blanc

blanc

A

1

blanc

blanc

blanc

blanc

blanc

blanc

blanc

blanc

12

Die 96-well-Platte wurde nach folgendem Plan mit den Wirkstoffen beladen:

Abb. 6: Behandlungschema in der 96-well-Platte für die Inkubationsexperimente.

47

Die so behandelten Zellen wurden für 24 respektive 48 Stunden im Brutschrank inkubiert. Danach schlossen sich die verschiedenen Messmethoden an.

2.4

Bestimmung der Zellzahl mittels Crystal-Violett

Der Versuch basiert auf der Methode von Gillies et al. (1986) [42]. Der Crystal-Violett-Test dient zur semiquantitativen Messung des Absterbeverhaltens der Zellen. Crystal-Violett (Nhexamethylpararosaniline) ist eine basische Färbesubstanz, die an die Nuklei der fixierten, lebenden Zellen bindet [35,42]. Nach Fixation und Auswaschen kann das an die Zellkerne gebundene Crystal-Violett wieder in Lösung gebracht werden und die Absorption der Lösung kann spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 590 nm gemessen werden. Hierbei ist die Absorptionsrate proportional zur Zellzahl der lebenden Zellen. Durch dieses schnelle und einfache Verfahren kann somit mit einer hohen Sensitivität die Zellzahl bestimmt werden.

Material:

- Crystal-Violet-Lösung: Crystal Violet 0,5%, 20% Methylalkohol, (Sigma - Aldrich) - 0,01M Tri-Natriumcitrat-Dihydrat in 50% Ethanol [0,01M] - Elisa-Reader (MRX Revelation, Vers. 4.21, Dynatech-Technologies) - Pipettierhilfe: accu-jet (Brand, Eppendorf research) - Filter Tips: Biosphere 1000 µl, 100 µl, 10 µl, (Sarstedt)

Methode:

Bei der Durchführung der Versuche wurde ähnlich vorgegangen wie bei den Arbeiten von Hueber et al. und Weller et al. beschrieben [56, 127]. Nach der Inkubation mit den Gelen und mit Mitomycin C, wurden diese aus den wells entfernt und jeder well zweimal mit 50 µl PBS gespült. Danach folgte die Fixation und Färbung der Zellen mit 50 µl Crystal-Violet-Lösung pro well für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Danach wurde die Lösung unter fließendem Wasser aus der Platte entfernt bis keine Farbe mehr in Lösung ging. Schließlich wurde die Platte zum Trocknen über Nacht gelagert. Das an die Kerne vitaler Zellen gebundene CrystalViolet wurde wieder in Lösung gebracht, indem jeder Well mit 50µl Natrium-Citrat [0.01M] 48

behandelt wurde. Die Absorptionsmessung erfolgte mittels ELISA-Reader bei einer Wellenlänge von 590nm. Die weitere Auswertung der Messung erfolgte am PC.

2.5

Caspase-3-Aktivitätsmessung

Die katalytische Aktivierung der Caspase 3 wurde durch ein fluorenszenztechnisches Verfahren ermittelt. Dabei macht man sich zu Nutzen, dass alle Caspasen die jeweils zu ihnen passende Zielsequenz eines Proteins ausschließlich nach Aspartat spalten. Eine fluoreszierende Substanz gekoppelt an diese Schnittstelle wird bei der Spaltung einer bestimmten Peptidsequenz durch die passende Caspase freigesetzt und kann durch photometrische Messung des Fluoreszenzsignals erfasst werden. Ein Beispiel für eine fluorogene Substanze ist 7-Amino-4Methyl-Coumarin (AMC).

Material:

- Caspase-3-Substrat (Ac-DEVD-AMC, Ac-Asp-Glu-ValAsp-AMC) 5mg, (Bachem), gelöst in 1ml DMSO - Lysepuffer: pH=8: Trsi/HCl 25mM, NaCl 60mM, EDTA 2,5mM, Tween 0,25% - PBS (phosphate-buffered saline, pH=7,3; 8,0 g/l NaCl; 1,15 g/l Na2HPO4; 0,2 g/l KH2PO4; 0,2 g/l KCl), (PAA) - CytoFluor 4000 Multi-Well-Reader, (PerSeptive, Biosystems, Framingham, MA, U.S.A.) - Pipettierhilfe: accu-jet (Brand, Eppendorf research) - 96-Well-Platte: tissue culture plate 96-well, flatbottomcell+, (Sarstedt) - Filter Tips: Biosphere 1000 µl, 100 µl, 10 µl, (Sarstedt)

Methode:

Bei der Durchführung wurde, wie in den Arbeiten von Wagenknecht et al. und Hueber et al. beschrieben, verfahren [57]. Die Zellen wurden wie oben beschrieben in einer 96-well-Platte inkubiert (25.000 Zellen/well) und mit den Gelen und Mitomycin C nach o.g. Plan für 24 Stunden behandelt. Danach wurden die Substanzen entfernt und jeder well zweimal mit 50 µl PBS gespült. Die Zellen wurden mit Lysispuffer (50 µl/well) für 10 Minuten inkubiert und anschließend wurde das jeweilige Substrat hinzugefügt, so dass eine Endkonzentration von 20 µM/well resultierte. Als 49

Standard dienten nicht behandelte, nicht apoptotische Zellen. Als Leerwert dienten zellfreie wells. Die Fluoreszenzmessung erfolgte in 10 Minuten Intervallen bei substratspezifischer Wellenlänge bis die Werte stabil waren: Caspase 3-Substrat (Ac-DEVD-AMC) bei 360 nm Exzitation und 460 nm Emission. Die Caspase-Aktivität wurde relativ zum Standard zu einem bestimmten Messzeitpunkt ausgewertet.

2.6

Western Blot

Das Western Blot – Verfahren ist eine immunochemische Methode zur Detektion von Proteinen. Dazu werden aus lysierten Zellen gewonnene Proteine in einem Gel ihrer Größe nach elektrophoretisch (oder auch durch Diffusion oder Kapillarwirkung) aufgetrennt und beim sog. Blot auf eine Trägermembran (Nitrocellulose, Nylon oder PVDF) übertragen. Die Proteine könne durch spezifische Primärantikörperbindung identifiziert werden. Sekundärantikörper binden wiederum an die Primärantikörper und machen mittels eines konjugierten Enzyms, das eine Farb- oder Chemilumineszenzreaktion katalysiert, diese Bindung sichtbar.

2.6.1 Proteinquantifizierung Die Bestimmung der Proteinmenge mittels Bicinchoninsäure ist auf der Arbeit von Smith et al. (1985) begründet [116]. Der Bicinchoninsäure-Assay (BCA-assay) zur Proteinbestimmung ist ein einfacher und schneller photometrischer Assay. Hierbei nutzt man die Tatsache, dass Cu2+-Ionen in alkalischem Milieu durch Proteine zu Cu1+-Ionen reduziert werden. Diese Cu1+-Ionen bilden zusammen mit Bicinchoninsäure (BCA) einen violetten Komplex dessen Absorptionsmaximum bei 562nm photometrisch messbar ist. Die Absorption ist in diesem Bereich proportional zur Proteinkonzentration im Messbereich von 20-2000 µg/ml.

Material:

- Lysispuffer: 50

Ripa-Puffer, NP40 1%, Deoxicholat 0,5%, SDS 1%, NaCl 0,9%, 150mM, Tris-HCl 50mM pH=8, alternativ: M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent (Thermo Scientific, Pierce Biotechnology) - Proteaseinhibitor: Protease inhibitor cocktail, 1ml, (Sigma, P1860) - PBS (phosphate-buffered saline, pH=7,3; 8,0g/l NaCl; 1,15g/l Na2HPO4; 0,2g/l KH2PO4; 0,2g/l KCl), (PAA) - Zellschschaber: Cell-scraper, 25cm (Sarstedt) - Sterile Arbeitsbank (Köttermann, 8580) - Vortexer: Vortex Genie2, (Scientific Industries) - Zentrifuge (Heraeus, Megafuge 1.0) - Reagenzgläser - Eis - Epp-Cups - Ultraschallbad - Pipettierhilfe: accu-jet (Brand, Eppendorf research) - 96-Well-Platte: tissue culture plate 96-well, flatbottomcell+, (Sarstedt) - BCA Protein Assy Kit (Thermo Scientific, Pierce) - Dynatech MR5000 ELISA-Reader (Wellenlänge 595nm) - Filter Tips: Biosphere 1000µl, 100µl, 10µl, (Sarstedt)

Methode:

Nachdem die Zellen für 24 Stunden je nach Behandlungsgruppe unter der Wirkung des Gels bzw. von Mitomycin C inkubiert worden waren, wurden sie zunächst mittels eines Zellschabers vom Untergrund gelöst, in einem Reagenzglas in kaltem PBS aufgenommen und schließlich 3 Mal in PBS bei 15.000 rpm für 1 Minute zentrifugiert und in ein Epp-Cup überführt. Hier nach konnten die Zellen entweder eingefroren werden oder direkt auf Eis weiterverarbeitet werden. Zur Lyse wurde zum Lysepuffer der Proteaseinhibitor im Verhältnis 1:100 gegeben und beides zu den Zellen gegeben und gut durchmischt. Bei einer Zahl von maximal 45x106 Zellen ergab sich ein nach Herstellerangaben benötigtes Volumen von 500μl Lysepuffer. Das Zelllysat wurde für 2 Minuten in ein Ultraschallbad gegeben und anschließend bei 13.000 rpm für eine Minute zentrifugiert. Der Überstand beinhaltete die benötigten Proteine, 51

wurde abgesaugt und in einem Epp-Cup zum Einfrieren oder zur weiteren Verarbeitung aufbewahrt; der Rest wurde verworfen. Um die gewonnene Proteinmenge je Behandlungsgruppe bestimmen zu können wurde der BCA Protein Assay Kit von Pierce benutzt. Dazu wurde eine Verdünnungsreihe eines Albumin-Standards und der Probenlysate auf einer Mikrotiterplatte hergestellt. Den Herstellerangaben folgend konnte so mit Hilfe eines ELISA-Readers anhand einer Proteinstandard-Kurve die Proteinkonzentration der einzelnen Proben bestimmt werden. Die Proben wurden schließlich bis zur weiteren Verwendung bei -80ºC gelagert.

2.6.2 SDS-PAGE Die Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophorese (SDS-PAGE) dient der Auftrennung der Proteine nach ihrer Größe. Dazu werden die Proteine zunächst denaturiert um ihre Sekundär- und Tertiärstruktur aufzubrechen. Je nach Größe des Proteins bindet SDS und gibt ihm so eine negative Ladung. Abhängig von der Größe bzw. Ladung der Proteine wandern dieses bei der Elektrophorese unterschiedlich schnell durch das Trenngel.

Material:

- Gel: - Trenngel 10%: Acrylamid 30%, Tris-HCl 1,5M, SDS 10%, aqua dest, TEMED, APS 10% - Sammelgel 5%: Acrylamid, Tris-HCl 0,5M, SDS 10%, aqua dest., TEMED, APS alternativ: Criterion XT Precast Gel 12% Bis-Tris, 18 Well Comb (BioRad Laboratories) - XT-sample Puffer (4x), 10ml (BioRad Laboratories) - XT-reducing Agent (20x), 1ml (BioRad Laboratories) - Wasserbad - Eis - Epp-Cups - Filter Tips: Biosphere 1000µl, 100µl, 10µl, (Sarstedt) - Pipettierhilfe, (Brand, Eppendorf) - Epp-Cup-Zentrifuge (Roth) - Molekulargewichtsmarker, Spectra Multicolor Broad Range Protein, 250µl (Fermentas) 52

- Amersham ECL protein molecular weight markers, 25µl (GE Healthcare) - Proben aus Zelllysaten - Positivkontrollen aus Zelllysat: - A-431 (p53) whole cell lysate (53kDa), 500µg/200µl, (sc2201 Santa Cruz) - RAW (Bax) whole cell lysate (23kDa), 500µg/200µl, (sc-2211 Santa Cruz) - Jurkat (Bcl-2) whole cell lysate (29kDa), 500µg/200µl, (sc-2204Santa Cruz) - Laufpuffer nach Laemmli: Tris-Base 3g/l, [25mM] (Sigma), Glycin 14,4g/l, [0,19mM] (Merck), SDS 1g/l, [0,1%], alternativ: XT-MOPS Running Buffer 20x (BioRad Laboratories), verdünnt mit aqua dest. - Criterion Cell Elektrophoresekammer (BioRad) - PowerPac HC (BioRad)

Methode:

Die SDS-PAGE wurde nach nach Herstellerangaben mit der Apparatur von BioRad durchgeführt. Wurden die Gele selbst hergestellt, wurde das Trenngel bis ca. 1 cm unter den Rand der zusammengebauten Glasplatten gegossen und zur Glättung vorsichtig mit Wasser überschichtet. Nach Polymerisation des Gels wurde das Wasser abgeschüttet und das Sammelgel aufgetragen. Durch das Einbringen eines Kamms wurden Ladetaschen für die Proben gebildet. Alternativ wurde das fertige XT-Gel 12% von BioRad benutzt. Das fertige Gel und der Laufpuffer wurden in die Laufkammern gegeben. Vor Einbringen in die Ladetaschen wurden die Proben, Laufmarker und Zelllysate/Positivkontrollen auf Eis vorbereitet. Der ECL-Marker und der gefärbte Molekulargewichtsmarker (Fermentas) wurden nach Herstellerangaben verdünnt und mit dem Ladepuffer vermischt. Die Proben und Positivkontrollen wurden mit 5-fach konzentriertem Ladepuffer und reducing-agent in einem Epp-Cup versetzt und wenn nötig mit aqua dest. auf ein Gesamtvolumen von 20μl verdünnt, so dass in jeder Tasche eine Proteinkonzentration von 1μg/μl herrschte. Bis auf den Molekulargewichtsmarker (Fermentas) wurden alle Proben bei 95ºC im Wasserbad für 5 Minuten denaturiert und kurz darauf auf Eis gelegt und zentrifugiert. Schließlich wurden die Taschen des Gels mit den Proben beladen und die Gelelektrophorese gestartet. Bei einer Spannung von 110 V wurde der Lauf in der Regel nach 70-90 Minuten unter Kontrolle der Laufbanden und des gefärbten Markers beendet. 53

2.6.3 Blotten Als Blot bezeichnet man den Transfer der Proteine auf eine Membran. Die Nirocellulosemembran ist die geeignete Matrix um die nachfolgende Antikörperreaktion durchzuführen.

Material:

- Transferpuffer: Tris-Base 48mM (Sigma), Glycin 39mM, SDS 0,35%, Methanol 20%, aqua dest. - Criterion Blotter Filterpapier 9,5 x 15,2 cm - Nitrocellulose-Membran 0,2 µm, Criterion Blotting Sandwiches (BioRad Laboratories) - Criterion Blotter (BioRad) - PowerPac HC (BioRad)

Methode:

Nach der Gelelektrophorese wurden die Gele zunächst für einige Minuten in Transferpuffer gelegt um die Salze auszuwaschen, dadurch erlangten die Proteine wieder ihre ursprüngliche Struktur zurück. Als Träger wurde eine Nitrocellulosemembran gewählt, die ebenfalls in ein Bad mit Transferpuffer eingelegt wurde. Für den Transfer mittels Elektrophorese wurde ein Sandwich-artiger Aufbau nach folgendem Schema gewählt: 1. Kathode 2. Fiber-Pad 3. Filterpapier 4. Gel 5. Nitrocellulosemembran 6. Filterpapier 7. Fiber-Pad 8. Anode Bei dem Aufbau wurde darauf geachtet, dass keine Luftblasen zwischen den Schichten entstehen, die Kassetten wurden fest verschlossen und in die mit Transferpuffer gefüllte Blotkammer gegeben. Der Transfer wurde bei 100 V für 75 Minuten durchgeführt. Als Erfolgskontrolle, dass die Proteine aus dem Gel auf die Membran übertragen wurden, dienten die 54

Banden des farbigen Proteinmarkers (Fermentas), die bei Erfolg gänzlich auf der Membran und nicht mehr im Gel zu finden waren.

2.6.4 Gegenfärbung mit Ponceau-S: Material:

- Ponceau-S staining solution, 0,1% Ponceau-S, 5% Essigsäure, (Sigma-Aldrich) - Pipettierhilfe: accu-jet (Brand, Eppendorf research) - Serologische Pipetten (Sarstedt)

Methode:

Die Methode der reversiblen Proteinfärbung ist auf die Arbeit von Salinovich et al (1986) zurückzuführen [104]. Nach erfolgreichem Blot wurde die Membran reversibel mit Ponceau-S gefärbt, wodurch zum einen beurteilt werden konnte, ob die Auftrennung der Proteine erfolgte und zum anderen überprüft werden konnte, ob die eingebrachte Proteinmenge je Tasche in jeder Tasche gleich war. Dazu wurde die Membran je 5 Minuten in PBS und aqua dest gewaschen. Danach erfolgte die Färbung mit unverdünnter Ponceau-S Lösung (Sigma) für ca. 5 Minuten. Die überschüssige Färbung wurde mit aqua dest. entfernt, die Membran wurde in eine durchsichtige Plastikfolie gelegt und fotokopiert. Das Detektionslimit der Ponceau-Färbung liegt bei 250ng separiertem Protein. Die Banden wurden wieder mit 0,1M NaOH entfärbt und anschließend mit aqua dest. gespült. Zum Schluss wurde die Membran mit Filterpapier umwickelt und getrocknet.

55

2.6.5 Immunreaktion Material:

- PBS-T (PBS; 0,1% Tween 20) - Milchpuffer (2,5g Magermilchpulver in 50ml PBS-T), (GE Healthcare) - Rüttler

Primärantikörper Antikörper

Tier

Verdünnung

Firma

Anti-p53 (DO-1)

Momoklonaler

1:100, 50µl + 5ml PBS

Santa Cruz, sc-126,

Maus-IgG Anti-Bcl2 (100)

Monoklonaler

[200µg/ml] 1:100, 50µl + 5ml PBS

Maus-IgG Anti-Bax (N-20)

Polyklonaler

Santa Cruz, sc-509, [200µg/ml]

1:100, 50µl + 5ml PBS

Kaninchen-Ak

Santa Cruz, sc-493, [200µg/ml]

Tabelle 1: Primärantikörper für Immunreaktion.

Sekundärantikörper Antikörper

Tier

Verdünnung

Firma

ECL anti-mouse IgG

F(ab)2 fragment from sheep

1:1000, 50µl +

(Amersham Bio-

50ml PBS

science)

HRP-linked ECL anti-rabbit IgG

F(ab)2 fragment from don-

1:1000, 50µl +

(Amersham Bio-

HRP-linked

key

50ml PBS

science)

Tabelle 2: Sekundärantikörper für Immunreaktion.

- ECL Streptavidin-HRP conjugate - Filter-Tips: Biosphere 1000µl, 100µl, 10µl, (Sarstedt) - Pipettierhilfe, (Brand, Eppendorf) - Entwicklergerät (AGFA) - Entwicklerkassette - Röntgenfilm (GE Healthcare, Amersham) - ECL-Detektionreagenz (Amersham, GE Healthcare) 56

Methode:

Nach erfolgreichem Blot wurde die Membran drei Mal für 5 Minuten in PBS-T gewaschen. Danach erfolgte mittels Milchpuffer die Blockierung unspezifischer Proteine für eine Stunde auf einem Rüttler gefolgt von erneutem Waschen mit PBS-T. Derweil erfolgte die Verdünnung der Antikörper nach Herstellerangaben (s. Tabelle oben). Die Membran wurde mit dem Primärantikörper für mindestens eine Stunde oder über Nacht im Kühlschrank und anschließend mit dem passenden Sekundärantikörper für eine Stunde liegend inkubiert. Nach jeder Inkubation wurden die Antikörper für etwaige Strips aufbewahrt und die Membran wieder mit PBS-T gewaschen. Um die Immunreaktion abzuschließen wurde das ECL-Streptavidin-HRP-conjugate (GE Healthcare) Herstellerangaben folgend auf die Membran gegeben und nach einer Stunde erneut gewaschen. Für die Chemilumineszenzreaktion wurden in einer Dunkelkammer die Detektionsreagenzien von Amersham benutzt (1:1, 0,125ml/cm2). Nach einer Reaktionszeit von ca. einer Minute wurde das Reagenz entfernt, die Membran in eine durchsichtige Folie gegeben und ein Film auf sie gelegt und beides in einer Entwicklerkassette verschlossen. Die ECL-Reaktion wurde anhand der Schwärzung des entwickelten Films zunächst nach einer Minute beurteilt wonach dann die Belichtungszeit auf verschiedene Filme gewöhnlich für 1, 3 und 5 Minuten variiert wurde bis die ECL-Reaktion schließlich aufhörte.

2.7

Statistik

Die Auswertung der Messungen aus dem Crystall-violett-Assay und den CaspaseAktivitätsmessungen wurde computerbasiert mit Hilfe von SPSS Vers. 18 durchgeführt. Da man bei kleinem Stichprobenumfang nicht von einer Normalverteilung der Daten ausgehen durfte, ist der weitläufig angewandte student t-test aus statistischer Sicht zur Analyse nicht korrekt, auch wenn er vermutlich ähnliche Ergebnisse hervorbrächte. Der nichtparametrische U-Test nach Mann-Whithney wurde zum Vergleich von Rangmittelwerten angewandt, um signifikante Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen und der Kontrolle festzustellen. Dabei wurde ein Signifikanzniveau von α=0,05 festgelegt. Die Nullhypothese konnte abgelehnt werden, wenn nach Wilcoxon der Betrag von Z > z

1-α/2

bzw. 1,96 war. Die Signifikanz

von Messunterschieden wurde mit dem p-Wert angegeben. Ein p-Wert kleiner als 0,05 gilt als signifikant und wurde mit (*) markiert. P-Werte < 0,01 wurden mit (**) und < 0,001 mit 57

(***) gekennzeichnet. Um das prozentuale Überleben der Zellen darstellen zu können, wurden die Messwerte der jeweiligen Behandlungsgruppe gemittelt und auf ihren jeweiligen Kontrollmittelwert bezogen. In der graphischen Darstellung wurde die Kontrolle auf 100% normiert.

58

3. Ergebnisse

3.1 Konzentration und Wirksamkeit von Mitomycin C

Es wurde jene Konzentration von Mitomycin C gesucht, bei der mindestens die Hälfte der 25.000 eingesäten Zellen nach 48h abstirbt. Diese Konzentration sollte für die Folgeversuche dienen. Die folgende Graphik stellt die optische Dichte (proportional zur Zellzahl) in Abhängigkeit von der Mitomycin C-Konzentration dar. Die Konzentrationen von 90 µM bis 360 µM wurden je durch 4-fach Messungen getestet und der Mittelwert bestimmt, der Standard stellt unbehandelte Zellen dar (n=10).

Abb. 6: Behandlung von humanen Tenonfibroblasten mit Mitomycin C unterschiedlicher Konzentration für 48h; SD = Standardabweichung

59

Abb. 7: Behandlung von humanen Tenonfibroblasten mit MitomycinC unterschiedlicher Konzentration für 48h, prozentuales Zellüberleben; SD = Standardabweichung.

Bei einer Konzentration von 180µM Mitomycin C ist die Überlebensrate mehr als deutlich halbiert worden.

Substanz

Überleben in % + SD

Kontrolle

100 + 4,9

Mitomycin 90µM

69,8 + 0,84

Mitomycin 135µM

56,46 + 3,43

Mitomycin 180µM

32,29 + 3,38

Mitomycin 225µM

14,82 + 1,46

Mitomycin 270µM

9,32 + 2,37

Mitomycin 315µM

4,85 + 1,09

Mitomycin 360µM

2,96 + 0,75

Tabelle 3: Übersicht über konzentrationsabhängiges Zellüberleben in Prozent

60

3.2

Crystal-violett-Assay

3.2.1 Ergebnis exemplarisch aus einem Einzelversuch

Nach Abschluss der Inkubation und Färbung mit Crystal-Violett zeigten sich in der mikroskopischen Kontrolle der einzelnen wells, je nach Behandlung unterschiedlich dicht bewachsene, teils konfluente Böden mit größtenteils länglichen Fibroblasten. Die Zellen und vor allem die Zellkerne waren stark angefärbt. Die Zellzwischenräume sowie die Ränder der wells waren frei von Farbresten.

Abb. 8: Behandlungsschema in der 96-well-Platte

61

Abb. 9: Exemplarische Darstellung einer 96-well-Platte nach Inkubation und Färbung mit Crystal-violett.

Die folgende exemplarische Darstellung einer einzelnen Versuchsreihe zeigt bei einer Stichprobenzahl von n=5 je Behandlungsgruppe folgende Ergebnisse einmal ohne und einmal mit Mitomycinbehandlung:

Abb. 10: Einzelversuch, optische Dichte abhängig von Behandlung, ohne MMC; *(p < 0,05), **(p < 0,01), ***(p