ATR-FTIR-spektroskopische Untersuchungen von membrangebundenem Ras

ATR-FTIR-spektroskopische Untersuchungen von membrangebundenem Ras

Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften der Fakultät für Biologie und Biotechnologie an der Internationalen Graduiertenschule Biowissenschaften der Ruhr-Universität Bochum

angefertigt am Lehrstuhl für Biophysik

vorgelegt von

Jörn Güldenhaupt aus Werne

Bochum April 2010

ATR-FTIR-spectroscopic analysis of membrane-bound Ras

Dissertation to obtain the degree Doctor of Natural Sciences at the Faculty of Biology and Biotechnology Ruhr-University Bochum

Department of Biophysics

submitted by

Jörn Güldenhaupt from Werne, Germany

Bochum April 2010

Erstgutachter: Zweitgutachter:

Prof. Dr. Klaus Gerwert Prof. Dr. Matthias Rögner

Für Jutta

suchen wissen ich was suchen ich nicht wissen was suchen ich nicht wissen wie wissen was suchen ich suchen wie wissen was suchen ich wissen was suchen ich suchen wie wissen was suchen ich wissen ich suchen wie wissen was suchen ich was wissen ERNST JANDL

Dankeschön Ich danke Herrn Professor Klaus Gerwert für die Vergabe dieses interessanten und herausfordernden Themas und für die Unterstützung und die großen Freiheiten bei der Ausgestaltung der Arbeit. Herrn Prof. Dr. Matthias Rögner danke ich für die Übernahme des Koreferats. Bei Carsten Kötting bedanke ich mich für viele gute Diskussionen, hilfreiche Anregungen und praktische Tipps sowie für das Korrekturlesen dieser Arbeit. Bei Herbert Waldmann, Jürgen Kuhlmann, Christine Nowak und besonders bei Gemma Triola bedanke ich mich für die Bereitstellung von lipidiertem Ras. Angela Kallenbach, Philipp Pinkerneil und Frederik Großerüschkamp danke ich für die Überlassung von einigen Aliquots Ras und Vergleichsspektren. Für einige interessante Gespräche, hilfreiche Tips und Überlassung von einigen Proben NoreRBD bedanke ich mich bei Daniel Filchtinski. Ich danke Christoph Pinske für die stets engagierte und gute Zusammenarbeit bei feinmechanischen Arbeiten und Harald Chorongiewski für die Unterstützung in Sachen Elektronik. Auch danke ich Jens Abrigata für die Unterstützung bei den Messungen und Simone Herrmann für die gute Zusammenarbeit. Yan Suveyzdis danke ich für die Zusammenarbeit beim Rop7-Projekt. Ein großes Danke geht an Sandra Grunitz und Carolin Krumpinski, die immer einen reibungslosen Ablauf von organisatorischen Dingen ermöglichten. Für Hilfestellungen bei meinen sporadischen Proteinaufreinigungen, deren Resultate allerdings nicht den Weg in diese Arbeit gefunden haben, möchte ich mich bei Frederik Großerüschkamp und Konstantin Gavriljuk bedanken. Bei Tobias Merkendorf und Erik Freier bedanke ich mich für die angenehme Zeit im gemeinsamen Büro und speziell bei Erik für viele hilfreiche Diskussionen, Tipps und Anregungen in technischen Fragen. Für die stets gute Stimmung im Raum 350 und eine hervorragende Zusammenarbeit danke ich Laven Mavarani, Sarah Jenrich, Philipp Pinkerneil und Anna Shtamm. Für theoretische Unterstützung möchte ich mich bei Steffen Wolf, Henrick te Heesen und besonders bei Till Rudack bedanken, mit dem die Diskussion über Ras-Membran-Dinge stets erfrischend war. Bei Steffen Krätzig möchte ich mich für seinen ungeheuren Einsatz dabei, uns Kaffee-

trinker mit Suchtmitteln zu versorgen und für die vielen Outdoor-Erfahrungsaustausche bedanken. Auch möchte ich allen Grafikkartentestern für ihr Engagement danken, den Roten für viele erfolgreiche Missionen, den Blauen für ebenso viele Herausforderungen.

Bei allen Mitarbeitern des Lehrstuhls für Biophysik möchte ich mich für das angenehme Arbeitsklima und die gute Zusammenarbeit bedanken.

Ein großes Dankeschön geht an meine Eltern, die mich während der Promotion aber auch während ganzen Studienzeit unterstützt, und mir den Rücken frei gehalten haben.

Ich danke Jutta für Alles - Danke!

Kurzzusammenfassung Die kleine GTPase Ras ist ein protoonkogenes Protein, das in 20 % aller Tumore mutiert ist. In vivo ist Ras über einen Lipidanker an die Plasmamembran gebunden und erfüllt dort seine zentrale Funktion als molekularer Schalter in zahlreichen Signaltransduktionskaskaden. Bislang existieren nur wenige biopysikalische Analysen von Ras in seiner nativen Membranumgebung. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, die ATR-FTIRspektroskopische Untersuchung von membrangebundenem Ras zu etablieren. Zunächst wurden festkörpergestützte Lipidmembranen auf dem internen Reflektionselement hergestellt, was die native Immobilisierung von lipidiertem Ras ermöglichte. Das membrangebundene Protein war mit seinen α-Helices eher senkrecht zur Membran ausgerichtet. Eine Sekundärstrukturanalyse ergab, dass die Membrananbindung nur geringfügige Auswirkungen auf die Proteinstruktur hat und ergab Hinweise darauf, dass der Lipidanker vorwiegend in β-Sheet-Struktur vorliegt. Mit dem γ-Phosphat-Analogon BeF− 3 konnten erstmals Differenzspektren zwischen dem ON- und OFF-Zustand von membrangebundenem Ras erzeugt werden. Der Vergleich mit Differenzspektren von Ras in Lösung ließ auf eine gleiche Konformation der Nukleotidbindetasche von membrangebundenem Ras und Ras in Lösung schliessen. Durch Etablierung des Nukleotidaustausches von membrangebundenem Ras konnte die intrinsische GTP-Hydrolyse charakterisiert werden. Die Kinetik der intrinsischen Hydrolyse und das Hydrolysedifferenzspektrum von membrangebundenem Ras wiesen nur geringe Unterschiede zu den in Lösung gemessenen Kinetiken und Spektren auf. Dies zeigt, dass weder die Membranimmobilisierung noch die orientierte Anbindung einen Einfluss auf die Nukleotidbindung und die Hydrolyseaktivität des Proteins hat. In ersten Protein-Protein-Interaktionsstudien von membrangebundenem Ras mit dem Effektor NoreRBD wurde keine membraninduzierte Änderung der Affinität festgestellt. Die erfolgreiche Etablierung ATR-FTIR-spektroskopischer Untersuchungen von membrangebundenem Ras ermöglicht nun die Bearbeitung einer Vielzahl von interessanten Fragestellungen. So könnten z.B. erstmals onkogene Ras-Mutanten differenzspektroskopisch charakterisiert werden und der Einfluss von möglicherweise pharmakologisch bedeutsamen small molecules auf den Aktivierungszustand von Ras analysiert werden. Weiterhin besteht nun die Möglichkeit, die Interaktion von Ras mit Effektoren, GAPs und GEFs in Membrannähe zu untersuchen. Durch Variation der Lipidzusammensetzung und Mutationsstudien von putativ membraninteragierenden Residuen können Ursache und biologische Konsequenzen der spezifischen Membranausrichtung ermittelt werden.

0

Abstract The small GTPase Ras is a proto-oncogenic protein that can be found in 20 % of all tumours. In vivo Ras is bound to the plasma membran by a lipid anchor and plays a central role as a molecular switch in numerous signal transduction pathways. There are until now only few biophysical analyses of Ras in its native membrane environment. Therefore, the objective of this thesis was to establish the ATR-FTIR-spectroscopic analysis of membrane-bound Ras. In a first first step solid supported lipid bilayers were assembled on the internal reflection element, allowing the subsequent immobilisation of lipidated Ras in its native conformation. The protein was bound to the membrane such that its α-helices were oriented in a perpendicular angle with respect to the membrane. The analysis of the secondary structure indicated that membrane binding of Ras leads only to minor effects on the protein structure. Moreover, the secondary structure analysis suggested that the lipid anchor exists predominantly in a β-sheet conformation. By using the γ-phosphate analogue BeF− 3 difference spectra of membrane-bound Ras between ON and OFF state could be obtained for the first time. Since these spectra were very similar to difference spectra of Ras in solution one can assume that the conformation of the nucleotide binding pocket of membrane-bound Ras is identical to that of Ras in solution. Establishment of the nucleotide exchange of membrane-bound Ras enabled the characterisation of its intrinsic GTP hydrolysis. The kinetics and the hydrolysis difference spectra obtained with membrane-bound Ras were nearly identical to those measured in solution. This shows that neither the membrane immobilisation nor the orientated binding influence the nucleotide binding or the hydrolysis activity. In a first set of protein-protein interaction experiments with membrane-bound Ras and its effector NoreRBD membrane-induced changes in the affinity could not be detected. The successfull establishment of ATR-FTIR-spectroscopic analyses of membrane-bound Ras now enables the more profound investigation of many interesting questions, e. g., the difference spectroscopic characterisation of oncogenic Ras mutants and the influence of putative pharmacologically relevant small molecules on the Ras active state. Moreover, the newly established technique now allows to gain deeper insight into the interaction of Ras with effector molecules, GAPs and GEFs in the vicinity of the membrane. By varying the lipid composition and mutation of potentially membrane-interacting residues the molecular basis and biological consequence of the specific membrane orientation of Ras could be elucidated.

1

Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung

6

1.1

Die GTPase Ras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

6

1.2

Regulation durch Ras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

7

1.3

Schalterfunktion von Ras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

9

1.4

Ras-Isoformen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

1.5

Ursache der unterschiedlichen biologischen Wirkung der Ras-Isoformen . . 12 1.5.1

Palmitoylierungszyklus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

1.5.2

Nanoclustering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

1.5.3

G-Domänenorientierung - novel switch-Modell . . . . . . . . . . . . 14

1.5.4

Protein-Lipid-Interaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

1.6

Semisynthetisches lipidiertes Ras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

1.7

Zielsetzung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

2 Material und Methoden 2.1

2.2

20

Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 2.1.1

Chemikalien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

2.1.2

Geräte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

2.1.3

Spezielle Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

2.1.4

Computerprogramme

2.1.5

Puffer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

2.1.6

Proteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

Biochemische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 2.2.1

BCA-Proteinkonzentrationsbestimmung . . . . . . . . . . . . . . . 24

2.2.2

Nukleotidaustausch von Ras in Lösung . . . . . . . . . . . . . . . . 24

2.2.3

H/D-Pufferaustausch von Proteinen in Lösung . . . . . . . . . . . 26

2.2.4

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie . . . . . . . . . . . . . . 26

2.2.5

DLS-Messung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

2

Inhaltsverzeichnis

2.2.6

Vesikelspreitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 2.2.6.1

Vorbereitung des Germanium IRE . . . . . . . . . . . . . 28

2.2.6.2

Herstellung kleiner unilammelarer Vesikel . . . . . . . . . 28

2.2.6.3

Ablauf der ATR-FTIR-spektroskopischen Messung der Vesikelspreitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

2.3

2.4

ATR-FTIR-Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 2.3.1

Infrarotspektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

2.3.2

Fourier Transform IR-Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

2.3.3

Attenuated total reflection FTIR-Spektroskopie . . . . . . . . . . . 32

2.3.4

Linearpolarisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 2.3.4.1

Orientierte Spektren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

2.3.4.2

Dichroitische Differenzspektren . . . . . . . . . . . . . . . 37

2.3.4.3

Ordnungsparameter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

2.3.4.4

Oberflächenkonzentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

2.3.5

Polarisatorineffizienz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

2.3.6

Berechnungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

Neue Messaufbauten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 2.4.1

Ventrobot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

2.4.2

Dichrobot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

2.5

Transmissions FTIR-Spektroskopie von Proteinen in Lösung . . . . . . . . 46

2.6

Sekundärstrukturanalyse mit FTIR-Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . 46

2.7

2.6.1

Grundlagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

2.6.2

Spektrenvorbereitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

2.6.3

Bandenzerlegung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

Globale Anpassung von 3D-Spektren mit MCR-ALS . . . . . . . . . . . . 50

3 Ergebnisse und Diskussion 3.1

54

Herstellung einer festkörpergestützten Lipidmembran . . . . . . . . . . . . 54 3.1.1

Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

3.1.2

Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

3.1.3

Vesikelspreitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

3.1.4

3.1.3.1

Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

3.1.3.2

Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

Geschlossenheit des SSLB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 3.1.4.1

Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

3.1.4.2

Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

3

Inhaltsverzeichnis

3.1.5

3.2

3.1.5.2

Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

3.1.7

Fazit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

Anbindung von lipidiertem Ras an einen SSLB . . . . . . . . . . . . . . . 67 3.2.1

Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

3.2.2

Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68 3.2.2.1

Spezifität, Assoziation und Dissoziation . . . . . . . . . . 68

3.2.2.2

Proteinorientierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72

3.2.2.3

Oberflächenkonzentration und Belegungsdichte . . . . . . 75

Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76 3.2.3.1

Anbindung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

3.2.3.2

Stabilität der Immobilisierung . . . . . . . . . . . . . . . 77

3.2.3.3

Orientierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77

3.2.3.4

Dimerisiert Ras an der Membran? . . . . . . . . . . . . . 79

Sekundärstruktur von membrangebundenem lipidiertem Ras . . . . . . . . 81 Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81 3.3.1.1

SSLB-Präparation und Proteinanlagerung . . . . . . . . . 81

3.3.1.2

Messung von Ras in Lösung

. . . . . . . . . . . . . . . . 82

3.3.2

Sekundärstrukturanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82

3.3.3

Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83

3.3.4

Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86

Differenzspektroskopie an Ras Monolagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89 3.4.1

Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

3.4.2

Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90

3.4.3

Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91

3.4.4 3.5

Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

Quantitative Infomationen über die erzeugten SSLBs . . . . . . . . 63

3.3.1

3.4

3.1.5.1 3.1.6

3.2.3

3.3

Planarität des SSLB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

3.4.3.1

BeF− 3 -Differenzspektren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92

3.4.3.2

BeF− 3 -Titrationen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95

Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97

GTP Hydrolyse von membrangebundenem Ras . . . . . . . . . . . . . . . 100 3.5.1

Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100

3.5.2

Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100

3.5.3

Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104 3.5.3.1

Nukleotidaustausch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104

3.5.3.2

Hydrolysespektren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107

4

Inhaltsverzeichnis

3.5.3.3 3.5.4 3.6

Hydrolysekinetik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110

Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111

Protein-Protein Interaktion von membrangebundenem Ras mit NoreRBD 114 3.6.1

Das Ras Effektorprotein Nore1A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114

3.6.2

Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115

3.6.3

Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117

3.6.4

Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121

3.6.5

Einfluss der Transportkinetik auf die Anbindungskinetiken . . . . . 122

3.6.6

Fazit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124

4 Zusammenfassung und Ausblick

126

5 Literaturverzeichnis

131

Abbildungsverzeichnis

142

Tabellenverzeichnis

144

5

1 Einleitung 1.1 Die GTPase Ras Das Ras-(Rat Sarcoma)-Protein ist ein Proto-Onkogen, das zur Gruppe der Guaninnukleotidbindenden Proteine, der sog. G-Proteine gehört, die an einer Reihe von regulatorischen Prozessen innerhalb der Zelle beteiligt sind. Eine eukaryontische Zelle enthält 100–150 verschiedene Arten von G-Proteinen, von denen die meisten entweder zur Gruppe der heterotrimeren G-Proteine oder zur Gruppe der sog. "kleinen GTPasen"gehören (Vetter und Wittinghofer (2001)). Heterotrimere G-Proteine bestehen aus drei Untereinheiten (α, β und γ), von denen die α-Untereinheit nukleotidbindend ist. Die Interaktion der heterotrimeren G-Proteine mit aktivierten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) führt zu einem Austausch von GDP zu GTP, was zur Dissoziation des Trimers und damit zu weiteren Reaktionen innerhalb einer nachgeschalteten Regulationskaskade führt. Heterotrimere G-Proteine sind vorwiegend in Regulationskaskaden eingebunden, die sinnesphysiologische und stoffwechselregulatorische Vorgänge steuern (Gilman (1987)). Die Gruppe der kleinen GTPasen umfasst monomere G-Proteine von 20–25 kDa Größe, die eine hohe Primärsequenzhomologie untereinander aufweisen und deren Funktion die intrazelluläre Singalweiterleitung bzw. -verarbeitung ist (Vetter und Wittinghofer (2001); Herrmann (2003)). Diese Gruppe besteht aus fünf Untergruppen, der Ras-, Rho/Rac-, Rab-, Sar1/Arf- und Ran-Familie. Die Proteine der Ras-Familie sind die Hauptkomponenten der intrazellulären Signalweiterleitung und regulieren das Zellwachstum, die Zelldifferenzierung und den programmierten Zelltod (Apoptose). Die Mitglieder der Rho/Rac-Familie regulieren das Zytoskelett, die der Rab-Famile und Sar1/Arf-Familie den intrazellulären Vesikeltransport und die GTPasen der Ran-Familie den Kerntransport und die Mikrotubulibildung (Takai et al. (2001)). Die erhebliche Bedeutung von Ras bei der Regulation von Zelldifferenzierung, Zellwachstum und Apoptose zeigt sich auch

6

1 Einleitung

darin, dass bei ca. 20 % aller Tumore Mutationen des Ras-Gens vorliegen (Downward (2003)).

1.2 Regulation durch Ras

Abbildung 1.1: Ras-Regulationszyklus. Ras liegt in zwei Zuständen, dem GTP-gebundenen ONZustand und dem GDP-gebundenen OFF-Zustand vor. Nur Ras im ON-Zustand interagiert mit Effektoren der Signaltransduktionskaskade (siehe Abb. 1.2). Der Übergang zwischen ON- und OFF-Zustand wird von GAPs und GEFs katalysiert, die wiederum durch andere Signale reguliert werden.

Ras ist auf der Innenseite der Cytoplasmamembran lokalisiert und nimmt dort eine zentrale Position im Signaltransduktionsnetzwerk ein. Die grundlegende Funktion von Ras innerhalb des Netzwerks ist der Wechsel zwischen dem GTP-gebundenen aktiven Zustand (ON) und dem GDP-gebundenen inaktiven Zustand (OFF). Je nach Zustand interagiert Ras unterschiedlich stark mit Effektorproteinen und beeinflusst so den Informationsfluss innerhalb der Signaltransduktionskaskade (Abb. 1.1). Da das gebundene GTP nur sehr langsam hydrolysiert und auch der Austausch von GDP zu GTP aufgrund der hochaffinen Bindung kaum abläuft, sind beide Zustände dieses molekularen „Schalters“ sehr stabil. In welchem Zustand sich Ras befindet, wird durch Interaktion mit GAPs (GTPase Activating Proteins) und GEFs (Guanine Nucleotide Exchange Factors) bestimmt, deren Nähe zu Ras wiederum durch externe Signale reguliert wird. Der Übergang vom ON- in den OFF-Zustand wird durch GAPs katalysiert, die die GTPHydrolyse um den Faktor 105 beschleunigen. Die Beschleunigung des Übergangs von

7

1 Einleitung

OFF nach ON wird durch GEFs erreicht, indem sie die Affinität von Ras zu Nukleotiden herabsetzen, was zu einem Austausch von GDP zu GTP führt (Abb. 1.1). In menschlichen Zellen werden mindestens neun verschiedene GEFs und acht verschiedene GAPs exprimiert, deren Rekrutierung zur Cytoplasmamembran wiederum unterschiedlich reguliert wird. Von der Gruppe der ca. zwanzig Effektoren von Ras, von denen einige auch als GAP oder GEF für andere GTPasen wirken, sind die Raf-Kinase und die PI3- (Phosphoinositol-3)-Kinase (PI3K) die bekanntesten Mitglieder.

Abbildung 1.2: Ras-vermittelte Signaltransduktionskaskade. Die Anwesenheit eines Wachstumsfaktors im extrazellulären Raum beeinflusst über eine Ras-vermittelte Signaltransduktionskaskade die Zellzyklusregulation und Transkription. Für nähere Erklärungen siehe Text (verändert nach Downward (2003)).

Eine über Ras und Raf verlaufende Signalkaskade beginnt mit der durch Anbindung eines Wachstumsfaktors induzierten Dimerisierung und Autophosphorylierung einer Rezeptortyrosinkinase (RTK). Dies führt zur Interaktion des Proteins SHC mit den phosphorylierten Tyrosinen der RTK, was wiederum zur Anbindung des Adapterproteins GRB2 an den Komplex aus TRK und SHC führt (Abb. 1.2). Durch die Bindung an GRB2 wird das GEF SOS (Son Of Sevenless) in Membrannähe gebracht, wo es den Nukleotidaustausch von Ras katalysiert. Die Serin/Threoninkinase Raf wird durch Interaktion mit dem aktivierten Ras an der Membran immobilisiert und so aktiviert. Das führt zur Phosphorylierung der Kinase MEK (Mitogen activated kinase/ERK Kinase)

8

1 Einleitung

durch Raf, die wiederum die Kinase ERK (Extracellular Regulated Kinase) phosphoryliert, welche in der Folge unter anderem Proteine des Zellkerns phosphoryliert und so die Transkription beeinflusst (Abb. 1.2, Downward (2003)). Die Interaktion zwischen Ras und seinen Effektoren wird durch Domänen mit einer stark konservierten Struktur, den sog. Ras-Bindedomänen (RBDs) hervorgerufen. Generell besitzen die RBDs hohe Affinitäten zu Ras, die Bereich von 0,1 bis 10 µM liegen. Gleichzeitig weisen sie sehr kurze Komplexlebenszeiten im mittleren Millisekundenbereich und sehr hohe Assoziationsratenkonstanten (ca. 10 µM−1 s−1 ) auf. Die Interaktion ist also sowohl hochdynamisch als auch hochaffin, was bedeutet, dass die RBDs das Ras nie lange besetzen, sondern dass in einem dynamischen Gleichgewicht aller vorhandenen Ras Interaktionspartner diejenigen RBDs mehr „Ras-Interaktions-Zeit“ bekommen, deren Komplex thermodynamisch stabiler ist (Herrmann (2003)).

1.3 Schalterfunktion von Ras Der unter 1.2 bereits erwähnte Schaltermechanismus von Ras ist durch große Unterschiede in der Konformation der Nukleotidbindetasche zwischen GTP- und GDP-gebundenem Ras bedingt. Die Nukleotidbindetasche besteht aus drei funktionellen Einheiten, dem P-Loop (As. 10–17), SwitchI (As. 32–38) und SwitchII (As. 59–67) (Vetter und Wittinghofer (2001)). Der P-Loop ist in der Nähe der Phosphate des Nukleotids gelegen, und bildet über Aminofunktionen von Seitenketten (K16) und des Proteinrückgrats (As. 13– 18) H-Brücken mit dem α- und β-Phosphat aus. Dahingegen wechselwirken die SwitchRegionen vorwiegend mit dem γ-Phosphat des GTP, zu dem die Aminosäuren T35 aus SwitchI und G60 aus SwitchII über ihre Peptid-NH-Gruppen H-Brücken ausbilden. Andere Residuen der Switch-Regionen interagieren mit dem γ-Phosphat indirekt über ein Mg2+ -Ion oder koordinierende H2 O-Moleküle. Die Vielzahl der Kontakte von SwitchI und SwitchII zum γ-Phosphat führt zu einer äußerst stabilen Konformation dieser Bereiche, wenn Ras GTP-gebunden vorliegt und zu einer sehr flexibelen, unstrukturierten Konformation im GDP-gebundenen Zustand. Da die Effektoren im Bereich der Switchregionen mit Ras interagieren, führt die geringe Strukturstabilität im GDP-Zustand zu einer stark verminderten Affinität und ist somit die Ursache der Schalterfunktionalität von Ras. Der Zustandswechsel von ON nach OFF wurde bereits FTIR-spektroskopisch untersucht und einige der bei dieser Reaktion auftretenden Differenzbanden durch ortspezifische Mu-

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1 Einleitung

Abbildung 1.3: 3D-Struktur von Ras. Gezeigt ist die NMR Struktur des GDP-gebundenen OFFZustands von Ras (1CRP, 9 von 20 Modellen, weiss) im Vergleich zu zwei Röntgenstrukturen vom ON-Zustand (schwarz, 1QRA(GTP) und 5P21(GppNHp)). Die Strukturelemente P-Loop (rot), SwitchI (grün) und SwitchII (blau) binden die Phosphate des Nukleotids. Die Effektor-bindenden Switch-Bereiche sind im OFF-Zustand sehr flexibel, was die Affinität zu Effektoren stark verringert.

tagenese und Isotopenaustausch zugeordnet. So konnte z.B. die Absorptionsfrequenz einer Markerbande des ON-Zustands bei 1689 cm−1 der Carbonyl-Gruppe des in SwitchI gelegenen Threonin 35 zugeordnet werden (Kötting et al. (2007)). Desweiteren konnten die Hydrolysedifferenzbanden der Phosphate durch die Verwendung von isotopenmarkierten Nukleotiden zugeordnet und anhand der Kinetik ihrer Differenzbanden Aufschluss über den molekularen Mechanismus der Hydrolyse gewonnen werden (Cepus et al. (1998)). Verschiebungen der Phosphatbanden bei Interaktion mit GAP lassen vermuten, dass es bei der GAP-katalysierten Hydrolyse zu Ladungsverschiebungen vom γ- zum β-Phosphat kommt (Allin et al. (2001)). Weiterhin gibt es Hinweise darauf, dass der katalytische Effekt teilweise auch durch die Verdrängung von Wassermolekülen aus der Ras-Bindetasche durch den sog. Arginin-Finger des GAPs verursacht wird (Kötting et al. (2008)). Darüberhinaus wurde mit zeitaufgelöster FTIR-Spektroskopie ein bei der GAPkatalysierten Hydrolyse vorkommendes Intermediat charakterisiert, dass aus RasGDP und einem proteingebundenem H2 PO− 4 -Ion besteht (Kötting et al. (2006)).

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1 Einleitung

1.4 Ras-Isoformen Es existieren vier Isoformen des Ras-Proteins, H(arvey)-Ras, N(euroblastoma)-Ras, K(irsten)-Ras4A und K(irsten)-Ras4B (nachfolgend K-Ras genannt), die mit Ausnahme von K-Ras4A (einer Splicevariante von K-Ras4B) ubiquitär in gleichem Maße exprimiert werden. Die Isoformen haben im Bereich der katalytisch aktiven G-Domäne (As. 1–166) ca. 90 % Sequenzidentität und auch die basalen Mechanismen der Signaltransduktionskaskaden sind bei H-Ras, N-Ras und K-Ras gleich. Obwohl in vitro auch die Aktivierung und Deaktivierung durch die gleichen GAPs und GEFs katalysiert wird, wirken K-Ras und H-Ras in der Zelle jedoch unterschiedlich effizient in den verschiedenen Regulationskaskaden. So wirkt z.B. K-Ras mehr in der Raf-1-vermittelten Kaskade, wohingegen die Aktivierung der PI3-Kinase eher über H-Ras verläuft (Hancock (2003)). Weitere Unterschiede der Isoformen zeigten sich bei Experimenten mit Knockout-Mäusen, in denen sich herausstellte, dass K-Ras-Knockout-Mäuse im Gegensatz zu N-Ras-, H-Ras- und H-Ras/N-Ras-Doppelknockoutmäusen nicht lebensfähig waren (Umanoff et al. (1995); Esteban et al. (2001)).

Abbildung 1.4: Unterschiede der C-Termini von Ras-Isoformen. Die drei Ras-Isoformen H-Ras, N-Ras und K-Ras (hier K-Ras4B) besitzen nahezu identische G-Domänen (As. 1–166) und unterschiedliche C-terminale sog. hypervariable Regionen (HVR, As. 167–188/189). Der Anker-Bereich der HVRs trägt je nach Isoform unterschiedliche Lipid-Modifikationen (verändert nach Hancock (2003)).

Diese Diskrepanz zwischen nicht zu unterscheidender in vitro-Aktivität und deutlichen in vivo-Unterschieden der Isoformen ist durch den sehr variabelen C-Terminus (HVR, hypervariable Region, As. 167–188/189), innerhalb dessen die Proteine weniger als 15% Sequenzähnlichkeit aufweisen, bedingt (Omerovic und Prior (2009)). Die HVR ist auch der Bereich, über den Ras durch Lipidmodifikationen an der Plasmamembran gebunden ist. Die Isoformen sind alle einfach farnesyliert und H- sowie N-Ras tragen zusätzlich eine bzw. zwei Palmitoylmodifikationen (Abb. 1.4). K-Ras hingegen weist einen Bereich positiv geladener Residuen auf, der über elektrostatische Interaktion zusätzliche Mem-

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1 Einleitung

branaffinität vermittelt. Der Ablauf der posttranslationalen Modifikationen der drei Isoformen beginnt im Cytoplasma mit der Farnsylierung des Cysteins der C-terminalen Erkennungssequenz CAAX durch die Farnesyltransferase (FTase). An der cytosolischen Seite des Endoplasmatischen Retikulums (ER) wird das AAX-Tripeptid durch die Endopeptidase Rca1 (Ras and a factor converting enzyme) entfernt und anschließend die Carboxy-Gruppe des Cysteins durch die Methytransferase Icmt (Isoprenylcysteine Carboxyl Methyltransferase) methyliert. Nach der Methylierung werden N-Ras und H-Ras ein- bzw. zweifach palmitoyliert (N-Ras am Cystein C181 und H-Ras an C181 sowie C184). Die palmitoylierten Proteine gelangen über den Golgi-Apparat und den sektretorischen Pfad zur Cytoplasmamembran, während das lediglich farnesylierte K-Ras über eine unbekannte, Golgi-unabhägige Route zur Plasmamembran gelangt (Hancock (2003); Omerovic und Prior (2009); Henis et al. (2009)). Trotz der unterschiedlichen Modifikationen und der unterschiedlichen Routen zur Plasmamembran ist das Ergebnis – die Plasmamembranlokalisierung – bei allen drei Isoformen gleich. Wodurch die Isoform-spezifischen Unterschiede hervorgerufen werden, soll im Folgenden kurz dargelegt werden.

1.5 Ursache der unterschiedlichen biologischen Wirkung der Ras-Isoformen Die unterschiedliche biologische Funktion der Ras-Isoformen ist nach heutigem Kenntnisstand auf eine unterschiedliche subzelluläre Lokalisation zurückzuführen. Da auch die mit Ras interagierenden Proteine spezifische Lokalisationen aufweisen, ergibt sich so ein Muster der räumlichen und zeitlichen Überschneidung von Proteinkonzentrationen, aus der die Isoform-spezifische Signalantwort resultiert. Diese Unterschiede in der Membranlokalisation sind auf eine Vielzahl von Einflüssen zurückzuführen, über deren jeweilige Anteile bislang zumeist nur qualitative Daten vorliegen (Omerovic und Prior (2009); Henis et al. (2009)). Einige der Einflussfaktoren dieser kompartimentierten Signalweiterleitung (compartmentalized signalling) sind im Folgenden aufgeführt.

1.5.1 Palmitoylierungszyklus Die palmitoylierten Isoformen H-Ras und N-Ras sind nicht konstant an der Plasmamembran (PM) immobilisiert, sondern können die Membran durch Depalmitoylierung wieder

12

1 Einleitung

verlassen. In fluoreszenzmikrokopischen Studien konnte gezeigt werden, dass ein schneller Austausch von H-Ras und N-Ras zwischen Plasmamembran und Golgi-Apparat existiert und dass dieser Austausch durch einen Palmitoylierungs/Depalmitoylierungs-Zyklus verursacht wird (Rocks et al. (2005)). Ein Unterschied zwischen den Isoformen zeigt sich in der Kinetik des Übergangs von der PM zum Golgi-Apparat, die bei H-Ras mit einer Halbwertszeit von 6 min ca. sechs mal langsamer ist als bei N-Ras mit einer Halbwertszeit von 1,1 min. Die H-Ras Mutante C184S, die keinen mittleren Lipidanker besitzt und somit die gleiche Verankerung wie N-Ras aufweisst, hatte auch die gleiche Kinetik wie N-Ras. Dies zeigt, dass die Anzahl der Palmitoylgruppen und weniger die Sequenz des HVR die Kinetik des Wechsels zwischen PM und Golgi-Apparat bestimmt (Rocks et al. (2005)). Das extrazelluläre Signal wird also nicht nur in den plasmamembranständigen Signalkomplexen verarbeitet, sondern auch in Form von aktiviertem Ras mit Isoformspezifischer Kinetik in das Zellinnere getragen.

1.5.2 Nanoclustering Mittels Elektronenmikroskopie und Immunogoldmarkierung wurde entdeckt, dass Ras nicht homogen an der Plasmambran verteilt ist, sondern je nach Isoform und ON/OFFZustand in Anhäufungen, den sog. Ras-Nanoclustern vorliegt (Prior et al. (2001)). Diese Cluster bestehen aus 6–8 Ras-Molekülen, haben einen Radius von mehr als 6 nm und sind mit einer Lebenszeit von ca. 0,5 s sehr transiente Strukturen (Henis et al. (2009)). Die Nanocluster sind in cholesterolabhängigen Bereichen der Plasmamembran, den sog. Rafts ebenso zu finden, wie in den cholesterolunabhängigen Bereichen (nähere Erklärungen zu Rafts finden sich in 1.5.4). So liegen die Nanocluster von inaktivem H-Ras vorwiegend in Raft-Bereichen und die von aktivem H-Ras in Nicht-Raf-Bereichen (Abb. 1.5). Bei N-Ras verhält es sich genau gegensätzlich, wohingegen K-Ras-Nanocluster im aktiven und inaktiven Zustand in Nicht-Raft-Bereichen mit negativ geladenen Lipiden zu finden sind (Roy et al. (2005)). Alle sechs Arten von Nanoclustern sind unabhängig voneinander und überlappen sich nicht. Zusätzlich zur Abhängigkeit vom Membranzustand wurde für H-Ras und K-Ras im aktiven Zustand eine Kolokalisation mit den Adapterproteinen Galectin1 (H-Ras) und Galectin3 (K-Ras) gefunden (Abb. 1.5). Aktiviertes K-Ras rekrutiert Galectin3 vom Cytosol zur Plasmembran, wo es Bestandteil der K-Ras-Nanoclustern wird. Plasmamembranständiges Galectin3 interagiert mit RasGRP4, einem GEF von H-Ras und N-Ras, und könnte so die Aktivierung dieser Isoformen beeinflussen (Plowman et al. (2008)). Dies

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1 Einleitung

Abbildung 1.5: Lokalisation von Ras-Nanoclustern in unterschiedlichen Membrandomänen. Die Änderung des Aktivierungszustands von H-Ras und N-Ras führt zum Wechsel in andere Membrandomänen. K-Ras ist in beiden Aktivierungszuständen in negativ geladenen Membranbereichen lokalisiert, die sich jedoch räumlich unterscheiden. In den Nanoclustern von aktivem H- und K-Ras wurde das Adapterprotein Galectin gefunden (verändert nach Plowman et al. (2008)).

zeigt, dass das Nanoclustering durch Steuerung der Lokalisation von Proteinen zu einer gekoppelten Signalantwort der Isoformen führen kann. Im Gegensatz zur offensichtlichen Bedeutung der Protein-Protein-Interaktionen für die Signalweiterleitung ist der Anteil der Protein-Lipid-Interaktion an der lateralen Segregation weitgehend unbekannt. Dass jedoch H-Ras, das nur am C181 palmitoyliert ist, den Nanoclustering-Phänotyp von N-Ras aufweisst, lässt vermuten, dass die direkte Interaktion mit der Membran einen zusätzlichen Einfluss auf die laterale Segregation der Isoformen hat (Plowman und Hancock (2005)).

1.5.3 G-Domänenorientierung - novel switch-Modell Nach Entdeckung der Ras-Nanocluster wurden in Zelldifferenzierungsassays der Einfluss von mehreren geladenen Residuen der G-Domäne und der HVR auf die Aktivität von H-Ras festgestellt. Bei diesen Residuen handelt es sich um D47 und E49 im Loop zwi-

14

1 Einleitung

Abbildung 1.6: Modell der Orientierungsänderung der G-Domäne von Ras. Das novel switch-Modell postuliert eine GTP/GDP-abhängige Ausrichtung der G-Domäne. Im GDP-Zustand sind die α-Helices von Ras eher senkrecht zur Membran orientiert, im GTP-Zustand liegen sie parallel zur Membran. Durch die unterschiedliche Orientierung hat α-Helix 4 nur im GTP-Zustand Kontakt mit der Membran, während die C-Term-Residuen (R169 und K170) im GDP-Zustand näher an der Membran sind. In beiden Orientierungen liegen SwitchI (SI) und SwitchII (SII) nicht in Membrannähe (verändert nach Gorfe et al. (2007b)).

schen β-Strand 2 und 3 (L2,3-Residuen), R128 und R135 in α-Helix 4 (H4-Residuen) und R169 und K170 die am Beginn der HVR liegen (C-Term-Residuen). Mutationsstudien in in vivo-Experimenten zeigten, dass durch einen Alaninaustausch der H4-Residuen Wachstum und Differenzierung vermindert werden, während ein Alaninaustausch der C-Term-Residuen den gegenteiligen Effekt (verstärktes Wachstum und vermehrte Differenzierung) hat. In diesen Studien konnte jedoch nur der Einfluss der Mutationen auf den Signaloutput der Regulationskaskade und auf die Lokalisation in verschiedenen Membrandomänen untersucht werden. Um ein Modell der molekularen Wirkung der fraglichen Residuen zu erhalten, haben die Autoren eine in Molekulardynamik-(MD)-Simulationen gefundene GTP-GDP-abhängige Orientierung vor dem Hintergrund der in vivo-Daten interpretiert. In ihrem Modell, das sie als „novel switch“-Modell bezeichnen, ist die Interaktion der H4-, L2,3- und C-Term-Residuen mit Lipidkopfgruppen für die Ausrichtung der G-Domäne relativ zur Membran verantwortlich. Als Ursache der Orientierungsabhängigkeit vom GDP/GTP-Zustand wird diskutiert, dass die Konformationsänderung der Switch-Regionen beim Übergang zwischen OFF- und ON-Zustand eine Strukturänderung der membranbindenden Regionen hervorruft. Dies könnte zu einer veränderten Membraninteraktion der o.g. Residuen und damit zu einer Orientierungsänderung der G-

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1 Einleitung

Domäne führen. Es wurde postuliert, dass die G-Domäne im GTP-Zustand so ausgerichtet ist, dass die α-Helices parallel zur Membran liegen und die L2,3- und die H4-Residuen Membrankontakte ausbilden (Abb. 1.6). Das GDP-gebundene H-Ras wäre laut Modell mit den α-Helices eher aufrecht ausgerichtet, so dass die L2,3- und C-Term-Residuen Kontakt mit der Membran haben. Die Ausrichtungsänderung der G-Domäne könnte ein regulatorisches Element darstellen, durch das die Interaktion mit GAPs, GEFs und Effektoren allein durch Verdeckung oder Präsentation der Bindestelle moduliert wird. Da eine Orientierungsänderung zu einer veränderten Membraninteraktion führen würde, könnte sie auch die in den Nanoclustering-Experimenten detektierten Raft-Abhängigkeiten erklären. Bislang gibt es jedoch keine in vitro-Experimente, die diese aus in vivo- und in silico-Ergebnissen abgeleitete Hypothese stützen oder wiederlegen könnten.

1.5.4 Protein-Lipid-Interaktion Im Zusammenhang mit dem Nanoclustering von Ras wurde eine Lokalisation von aktivem N-Ras und inaktivem H-Ras in Lipid-Rafts entdeckt. Lipid-Rafts sind Cholesterolund Sphingomyelin-haltige Bereiche der Plasmamembran, die Durchmesser von 99 % D)

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen

DTT (1,4-Dithiothreitol)

Biomol, Hamburg

EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure)

Merck, Darmstadt

GDP (Guanosin-5’-diphosphat

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen

Dinatriumsalz) GTP (Guanosin-5’-triphosphat

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen

Dinatriumsalz) Natriumchlorid

Baker, Deventer NL

Natriumfluorid

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen

Natriumhydroxid

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen

Magnesiumdichlorid

Baker, Deventer, NL

MES (2-N-Morpholinoethansulfonsäure)

Biomol, Hamburg

POPC (1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-

Lipoid GmbH, Ludwigshafen

phosphocholine) Lysozym

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen

Salzsäure

Baker, Deventer, NL

SDS (Natriumdodecylsulfat)

Amersham Biosciences, Freiburg

TBAB (Tetrabutylammoniumbromid)

Merck, Darmstadt

Tris (Tris-hydroxymethylaminomethan)

Biomol, Hamburg

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2 Material und Methoden

Allgemein gebräuchliche Laborchemikalien wurden, falls nicht anders vermerkt, von den Firmen Fluka (Neu-Ulm), J. T. Baker (Deventer, NL), Biomol (Hamburg), Merck (Darmstadt) oder Sigma-Aldrich (München) bezogen.

2.1.2 Geräte Aquaspec Transmissionseinheit

Micro-Biolytics GmbH, Esslingen am Neckar

ATR-Einheit (25 Reflektionen)

Specac, Orpington, UK

ATR-Küvetten

Feinmechanikwerkstatt, Fakultät für Biologie, Bochum

ATR-Küvettentemperiereinheit

Feinmechanikwerkstatt, Fakultät für Biologie, Bochum

Brutschrank, Kelvitron 1

Heraeus, Bad Oeynhausen

Eppendorf Thermomixer comfort

Eppendorf, Hamburg

FTIR-Spektrometer Tensor 27

Bruker, Ettlingen

FTIR-Spektrometer IFS 66

Bruker, Ettlingen

FTIR-Spektrometer Vertex 80v

Bruker, Ettlingen

HPLC-Anlage System Gold

Beckmann, München

Öl-Bad-Schüttler Modell C76

New Brunswick Scientific, Edison, US

Particle Sizer (DLS-Gerät)

Malvern, Worchestershire, UK

pH-Meter 761 Calimatic

Knick, Berlin

pH-Einstabmeßkette 423

Mettler-Toledo, Steinbach

Plasma Cleaner

Harrick Plasma, Ithaca, USA

Schlauchpumpe REGLO Digital MS-4/8

Ismatec, Wertheim-Mondfeld

Kryostat RC6CP (80V)

Lauda, Lauda-Königshofen

UV-VIS Spektrometer Ultrospec 3000pro

Amersham, Freiburg

Ultraschall Gerät Sonifier W-250 D mit

Heinemann, Schwäbisch-Gmünd

Hochintensitätsaufsatz Cup Horn Waage BP 310 P

Sartorius, Göttingen

Waage 2004 MP6

Sartorius, Göttingen

Wasseraufbereitungsanlage, Milli-Q Plus

Millipore, Eschborn

Alle nicht gesondert aufgeführten Geräte entsprechen dem allgemeinen Laborstandard.

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2 Material und Methoden

2.1.3 Spezielle Materialien Germanium ATR Kristall (52 x 20 x 2 mm,

ACM, Villiers-Saint-Frédéric, FR

45 ° trapezoid) Diamantpolierpaste Polymant-P

Gerd Sommer, Usingen

KRS-5 Polarisator (25 mm Apertur)

Specac, Orpington, UK

Magnetventile EXAK-3, 12V

Takasago Electric, JP

Mikrokonzentratoren 10.000 MWCO

Millipore, Schwalbach

Pumpschlauch Tygon R 3607

Ismatec, Wertheim-Mondfeld

Zebaspin Entsalzungs Säulen

Pierce Biotechnology, Rockford, US

2.1.4 Computerprogramme Active Perl 5.8.8

www.activestate.com

als2004 (Matlab Programm)

http://www.ub.edu/mcr

Corel Draw X4

Corel GmbH, Unterschleissheim

Gnuplot

www.gnuplot.info

Jabref 2.5

http://jabref.sourceforge.net

Kinetics (Matlab Programm)

Erik Goormaghtigh (Prof. Erik Goormaghtigh, ULB Brüssel, BE)

Matlab R2006b

The MathWorks, Natick, US

Microsoft Office 2003

Microsoft, Redmont, US

MikTeX 2.7

http://miktex.org

Opus 6

Bruker, Ettlingen

Origin 7.5

OriginLab Corporation, Northampton

Pymol 0.99rc6

http://www.pymol.org

TeXnicCenter

http://www.texniccenter.org

Vector NTI Suite 9

Informax, Oxford, GB

Visual MINTEQ 2.61

http://www.lwr.kth.se/English /OurSoftware/vminteq/index.html

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2 Material und Methoden

2.1.5 Puffer Puffer A

Puffer B

10 mM Tris-HCl

100 mM NaCl

5 mM MgCl2

in Puffer A

pH 7,4 Puffer C

Puffer D

20 mM Tris-HCl

50 mM MES

5 mM MgCl2

100 mM NaCl

1 mM DTT

5 mM MgCl2

0,1 mM GDP

1 mM DTT

pH 7,4

0,1 mM GDP pH 6,5

Puffer NA

Puffer NB

50 mM MES

50 mM MES

100 mM NaCl

100 mM NaCl

10 mM EDTA

5 mM MgCl2

1 mM DTT

1 mM DTT

1 mM GTP

pH 6,5

pH 6,5

2.1.6 Proteine Semisynthetisches lipidiertes N-Ras (HDFar-MIC-N-Ras1-181) wurde von Gemma Triola bzw. Jürgen Kuhlmann (MPI für physiologische Chemie, Dortmund) zur Verfügung gestellt. Der Lipidanker (As. 181 - 188) wurde in der Abteilung von Prof. Herbert Waldmann (MPI für physiologische Chemie, Dortmund) synthetisiert und über eine Maleimido-Caproyl-Gruppe an das C-terminale Cystein von N-Ras1-181 (Swiss Prot ID: P01111, H. sapiens) ligiert. Diese Ligation und die nachfolgende Aufreinigung, sowie die Expression und Aufreinigung von N-Ras1-181 wurde von Christine Nowak (MPI für physiologische Chemie, Dortmund) wie in Tucker et al. (1986); Kuhn et al. (2001); Nagele et al. (1998) beschrieben durchgeführt.

23

2 Material und Methoden

H-Ras1-166 wurde von von Angela Kallenbach (LS für Biophysik, Ruhr Universität Bochum) zur Verfügung gestellt und wie in Tucker et al. (1986) beschrieben exprimiert und aufgereinigt (Swiss Prot ID: P01112, H. sapiens). N-RasStrepHis wurde von Philipp Pinkerneil (LS für Biophysik, Ruhr Universität Bochum) zur Verfügung gestellt und im Rahmen seiner Diplomarbeit nach Tucker et al. (1986) exprimiert und aufgereinigt (Swiss Prot ID: P01111, H. sapiens). Allerdings wurde hier eine Ni-NTA-Säule anstatt einer Anionentauschersäule verwendet (siehe Pinkerneil (2009)). NoreRBD (Nore1A-RBD, As. 199-358, E217K) wurde von Daniel Filchtinski (LS für Physikalische Chemie 1, Ruhr Universität Bochum) zur Verfügung gestellt und nach Wohlgemuth et al. (2005) exprimiert und aufgereinigt (Swiss Prot ID: Q5EBH1, M. musculus). Die Mutation E217K hatte keinen Effekt auf die Interaktion mit Ras (persönliche Mitteilung Daniel Filchtinski), weshalb sie in dieser Arbeit dem Wildtypprotein gleichgesetzt wird.

2.2 Biochemische Methoden 2.2.1 BCA-Proteinkonzentrationsbestimmung Zur Bestimmung der Proteinkonzentration wurde die Bicinchoninsäure-Proteinbestimmung (BCA-Test) nach Smith et al. (1985) durchgeführt. Hierbei wird ausgenutzt, dass Cu2+ -Ionen durch die Peptidbindung von Proteinen und durch bestimmte Aminosäuren (Cystein, Cystin, Tyrosin, Tryptophan) zu Cu+ reduziert wird. Ein Cu+ -Ion bindet zwei BCA-Moleküle unter Bildung eines farbigen Komplexes, dessen Konzentration photometrisch durch Messung der Absorption bei 562 nm ermittelt werden kann. Es wurde ein Probenvolumen von 50 µl mit 20 µl 4%iger CuSO4 -Lösung und 1 ml BCALösung versetzt. Nach 30 min Inkubation bei 37 °C wurde die E562 nm bestimmt. Die Proteinkonzentration wurde durch Kalibrierung mit einer Konzentrationsreihe von BSA bestimmt.

2.2.2 Nukleotidaustausch von Ras in Lösung Ras liegt nach der Aufreinigung im GDP-gebundenen Zustand vor und musste daher für die Hydrolysemessungen in Lösung in den GTP-gebundenen Zustand überführt werden.

24

2 Material und Methoden

Dieser Nukleotidaustausch wurde mittels der EDTA-Methode durchgeführt, in der die Nukleotidaffinität von Ras durch einen EDTA-vermittelten Entzug des an der Nukleotidbindung beteiligten Mg2+ -Ions verringert wird (Tucker et al. (1986); Lenzen et al. (1998)). Hierzu wird RasGDP zusammen mit EDTA und einem Überschuss von GTP inkubiert, so dass sich ein nur vom GDP/GTP-Verhältnis abhängiges Gleichgewicht von RasGDP und RasGTP einstellt. Da Ras ohne Mg2+ kein GTP hydrolysiert, startet die Hydrolysereaktion erst, wenn das Protein in den Messpuffer überführt wird. Dieser Schritt wurde mit zentrifugierbaren Gelfitrationssäulen (Zebaspin) durchgeführt, wodurch nur ein geringer Anteil des GTP vor Messbeginn hydrolysieren konnte. Puffer NA

Puffer NB

50 mM MES

50 mM MES

100 mM NaCl

100 mM NaCl

10 mM EDTA

5 mM MgCl2

1 mM DTT

1 mM DTT

1 mM GTP

pH 6,5

pH 6,5

Der Nukleotidaustausch wurde bei RT mit 3 mg Protein in 200 µl Startvolumen (Puffer C) nach folgender Prozedur durchgeführt. 1. 200 µl Ras-Lösung + 800 µl Puffer NA (Mg2+ :EDTA ist 1:10). 2. Mit Ultrafiltrationssäulen (10 kDa MWCO) in 2 Schritten je 500 µl auf ein Volumen von 100 µl einkonzentrieren. 3. auf 500 µl mit Puffer NA auffüllen und erneut auf ein Volumen von 100 µl einkonzentrieren. 4. 30 min bei RT inkubieren (GTP:GDP ist 40:1, also maximal 97,5 %iger Austausch möglich). 5. Während der Inkubation equilibrieren der Gelfiltrationssäule mit Puffer NB nach Herstelleranleitung. 6. Zugabe von 4 µl 0,5 M MgCl2 und sofortiges Beladen der Säule (Mg2+ :EDTA ist 2:1, Start der Reaktion).

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2 Material und Methoden

7. Elution durch Zentrifugation der Gelfiltrationssäule für 1 min bei 2000 rpm. 8. Sofortiges Einsetzen in die FTIR-Messung, Nukleotidbestimmung per HPLC oder Einfrieren in flüssigen Stickstoff und Lagerung bei -80 °C.

2.2.3 H/D-Pufferaustausch von Proteinen in Lösung Zur Analyse der Sekundärstruktur von Proteinen in Lösung wurden die in H2 O-Puffer gelagerten Proteine zunächst in D2 O-Puffer überführt (H/D-Austausch). Dieser Pufferwechsel wurde durch mehrmalige Verdünnungs- und Einkonzentrierungsschritte unter Verwendung von deuteriertem Puffer C (pD = 7,8) und Mikrokonzentratoren erreicht. Es wurden 1,8 mg Protein in 100 µl Volumen eingesetzt und der Pufferwechsel bei 4 °C nach folgender Prozedur durchgeführt. 1. 100 µl Proteinlösung + 400 µl D2 O-Puffer wurde im Mikrokonzentrator gemischt und in ca. 5 min bei 13000 rpm auf 50 µl einkonzentriert. 2. Zugabe von 450 µl D2 O-Puffer und Einkonzentrierung auf 50 µl. 3. Zweimalige Wiederholung von 2. (ergibt einen Verdünnungsfaktor von 1:5000) 4. 10 - 14 h Inkubation vor dem Einsetzen in die FTIR Messung. Der mit dieser Prozedur erreichte HD-Austausch mit einem Verdünnungsfaktor von 5000 führt aufgrund des sich zwischen H2 O, HDO und D2 O einstellenden Gleichgewichts zu einer Extinktion der δ(H2 O)-Biegeschwingung von weniger als 0,001 und kann damit ausreichend vollständig angesehen werden.

2.2.4 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie Die Nukleotidbeladung der verwendeten Ras-Proteine (2.2.2) wurde durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit UV-Detektion ermittelt. Hierbei wurde die Technik der reversed phase chromatography eingesetzt, bei der die Retentionszeit der aufzutrennenden Stoffe anhand ihrer Adsorption an eine hydrophobe Säulenmatrix bestimmt wird. Die unterschiedliche Adsorption der aufzutrennenden Di- und Triphospate wurde durch Zugabe des Ionenpaar-Reagenz TBAB erreicht, das an Phosphate bindet und so deren Hydrophobizität erhöht.

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2 Material und Methoden

Es wurde eine ODS-Hypersil-Säule (5 µm, 250 mm × 5 mm) verwendet, die mit HPLCPuffer (50 mM KH2 PO4 /K2 HPO4 , 100 mM TBAB, 15 % Acetonitril, pH 6,5) bei einer Flussrate von 1,2 ml/min betrieben wurde. Es wurden jeweils 2 µl Proteinlösung injiziert und die Messung anhand der Extinktion bei 254 nm über eine Messdauer von 7 min verfolgt. Der Anteil von GTP (RGT P ) am Gesamtnukleotid wurde durch Integration der Peaks von GDP (AGDP ) bei ca. 2,7 min und GTP (AGT P ) bei ca. 3 min mit RGT P = AGT P /(AGT P +AGDP ) bestimmt.

2.2.5 DLS-Messung Die Methode der dynamischen Lichstreuung (DLS, dynamic light scattering) wurde verwendet, um Vesikelgrössen und die Homogenität der Grössenverteilung (PDI, Polydispersitätsindex) der Vesikel zu bestimmen. Die Methode basiert auf der Abhängigkeit der Diffusionsgeschwindigkeit von der Teilchengrösse. Hierzu wird die Streuung eines Laserstrahls an Teilchen im Probenvolumen zeitabhängig detektiert und anhand der zeitlichen Korrelation der Streuung der translationale Diffusionskoeffizient D berechnet. Mit bekannter Temperatur T unter Einbeziehung der Boltzmann-Konstante k und bekannter Lösungsviskosität η kann der hydrodynamische Durchmesser d(H) durch die Stokes-Einstein-Gleichung berechnet werden (Gl. 2.1). d(H) =

kT 3πηD

(2.1)

Zur Grössenbestimmung der präparierten Vesikel wurden 100 µl Vesikellösung mit 400 µl Puffer A verdünnt und bei 25 °C in 10 Messreihen vermessen.

2.2.6 Vesikelspreitung Die Methode der Vesikelspreitung wurde zur Herstellung von festkörpergestützten Lipidmembranen (SSLB) auf dem internen Reflektionselement (IRE) angewandt. Diese Methode beruht darauf, dass kleine unilammelare Vesikel (SUVs, small unilammelar vesicles) beim Kontakt mit hydrophilen Oberflächen platzen und einen Lipidbilayer auf der Oberfläche ausbilden (Raedler et al. (1995); Richter et al. (2006)).

27

2 Material und Methoden

2.2.6.1 Vorbereitung des Germanium IRE Vor jeder Vesikelspreitung wurde der Germaniumkristall beidseitig mit Diamantpolierpaste der Partikelgrößen 1, 0,25 und 0,1 µm mit einem weichen Papiertuch von Hand poliert, bis der Kristall eine gleichmässig spiegelnde und schlierenfreie Oberfläche aufwies. Nach den einzelnen Polierschritten wurde der Kristall mit A. dest gespült und mit Stickstoff trockengeblasen. Danach wurde der Kristall zur Hydrophilisierung der Oberfläche 10 min in konzentrierter Schwefelsäure inkubiert, anschliessend mit A. dest gespült und mit Stickstoff trockengeblasen. Die Hydrophilität der Oberfläche wurde hierbei anhand der Benetzung des Kristalls durch A. dest kontrolliert. Abschliessend wurde der Kristall für 5 min einem Sauerstoffplasma (Plasmacleaner, Luftplasma) ausgesetzt, wobei Reste von organischen Substanzen oxidiert und evaporiert und die Oberfläche zusätzlich hydrophilisiert werden sollte. Danach wurde der Kristall unverzüglich in die ATR-Küvette eingebaut und mit dem Ablauf der Vesikelspreitung begonnen.

2.2.6.2 Herstellung kleiner unilammelarer Vesikel Zur Herstellung kleiner unilammelarer Vesikel (SUV, small unilammelar Vesicles) wurden 50 µl einer 25 mg/ml POPC-Stocklösung, gelöst in Chloroform (CHCl3 ) in einem 500 µl Reaktionsgefäß im Stickstoffstrom eingedampft. Zur vollständigen Verdampfung des CHCl3 wurde der Ansatz 1 h bei 20 mbar im Vakuum inkubiert. Aus den Lipidfilmen wurde durch Hydratisierung mit 200 µl Puffer A und anschliessende Inkubation für 1 h bei 37 °C und 1200 rpm im Thermomixer eine Suspension aus multilammelaren Liposomen hergestellt, die bis zur weiteren Benutzung bei -20 °C gelagert wurde. Nach dem Auftauen wurde diese Suspension mittels eines Reagenzglasschüttlers stark gemischt und für 10 min bei 4 °C mit Ultraschall behandelt (Cup-Horn-Aufsatz für 500 µl Reaktionsgefäße), wodurch SUVs von 30 - 60 nm Durchmesser erzeugt wurden. Von dieser SUVSuspension wurden direkt nach der Herstellung 100 µl in die ATR-Messung (2.2.6.3) und 100 µl in die DLS-Messungen (2.2.5) eingesetzt.

2.2.6.3 Ablauf der ATR-FTIR-spektroskopischen Messung der Vesikelspreitung Während der Herstellung des SSLB wurden ATR-FTIR-Messungen durchgeführt, so dass Informationen über den Ablauf des Spreitungsprozesses und die Qualität des erzeugten

28

2 Material und Methoden

SSLB erhalten wurden. Die Messungen wurden, falls nicht anders beschrieben, bei 20 °C mit den in 2.5 aufgelisteten Spektrometereinstellungen durchgeführt. Alle Puffer waren filtriert, entgast und auf Raumtemperatur equilibiert. Die Messungen verliefen nach folgenden Protokoll: 1. Vorbereitung des Germanium-Kristalls (2.2.6.1), Auftauen und Mischen der Liposomensuspension (2.2.6.2). 2. Behandlung der Liposomensuspension mit Ultraschall, während sich der Kristall im Plasmacleaner befindet (2.2.6.2). 3. Den Kristall nach der Plasmabehandlung in die ATR-Küvette einbauen, ins Spektrometer einsetzen und 3 min mit Puffer A im Durchfluss spülen. Aufnahme eines Referenzspektrums, Start einer Messung. 4. Durchfluss auf zirkulierend einstellen, 400 µl Puffer A in 1,5 ml Reaktionsgefäß für 2 min zirkulieren. Aufnahme eines Referenzspektrums, Start einer Messung. 5. Aufnahme eines Referenzspektrums, Start einer Messung für 120 min, Zugabe von 100 µl Vesikellösung, 60 min Inkubation im zirkulierenden Durchflussvolumen. 6. 60 min mit Puffer A im Durchfluss spülen. Nach Beendigung einer Messreihe, die meist aus einer Vesikelspreitung, einer Ras-Anlagerung und veschiedenen Experimenten mit dem angelagerten Ras bestand, wurde die Küvette einschliesslich Pumpschlauch mit 10 ml einer detergenzhaltigen Lösung (Detergenz:A. dest = 1:10) gespült, danach mit Stickstoff trockengeblasen und mit 10 ml A. dest gewaschen. Der Wasch- und Trockenprozess wurde nachfolgend zweimal wiederholt, um die Detergenzreste vollständig zu entfernen.

2.3 ATR-FTIR-Spektroskopie 2.3.1 Infrarotspektroskopie Die Infrarot-(IR)Spektroskopie ist eine absorptionsspektroskopische Methode, bei der die Proben mit Infrarotstrahlung mit Wellenlängen von 1 µm - 1 mm bestrahlt werden. Die Absorption der Infrarotstrahlung führt zur Schwingungsanregung von Molekülen, wobei nur diejenigen Schwingungsmoden angeregt werden, bei denen sich das Dipolmoment des

29

2 Material und Methoden

Moleküls während der Schwingung ändert. Vereinfacht kann die Absorptionsfrequenz eines zweiatomigen Moleküls anhand des Modells des harmomischen Oszillators nach Gl. 2.2 berechnet werden. Dieses Konzept der klassischen Mechanik beschreibt die Abhängigkeit der Frequenz ν von der Federkonstante k (der Bindung) und der reduzierten Masse des Systems µ (Moleküls), wobei sich die reduzierte Masse aus den Einzelmassen m1 und m2 der beteiligten Atome nach Gl. 2.3 berechnet.

µ=

s

k µ

(2.2)

m1 · m2 m1 + m2

(2.3)

1 ν= · 2π

In diesem Modell ist das Bindungspotential durch eine Parabel mit äquidistanten Energieniveaus beschrieben. Da es jedoch bei einer starken Stauchung der Bindung zu einer sehr grossen Abstossung der Atome und bei einer starken Dehnung zum Bruch der Bindung kommt, ist das Modell nur eine erste Nährung für Bindungen mit geringer Auslenkung. Ein realistischeres Modell, das die abstossenden und dissoziativen Anteile mit einbezieht, ist das Modell des anharmonisches Oszillators.

2.3.2 Fourier Transform IR-Spektroskopie

Abbildung 2.1: Schematischer Aufbau von IR-Spektrometern. A: Dispersives Spektrometer bei dem die spektrale Auflösung durch ein Gitter als dispersives Element erreicht wird. B: Beim Fourier Transform Spektrometer wird die spektrale Information durch das Michelson Interferometer generiert, als Interferogramm aufgezeichnet und durch Fourier-Transformation in ein Spektrum gewandelt.

30

2 Material und Methoden

Die Fourier-Transform- (FT) IR-Spektroskopie basiert auf der Verwendung eines Michelson-Interferometers anstatt dispersiver Elemente wie Gitter oder Prismen zur Generierung von spektraler Information (Abb. 2.1A). Ein Michelson-Interferometer besteht im wesentlichen aus einem Strahlteiler, sowie einem festen und einem beweglichen Spiegel (Abb. 2.1B). Die IR-Strahlung der thermischen Strahlungsquelle, dem sog. Globar, wird am Strahlteiler in zwei Teilstrahlen aufgeteilt, von denen einer am festen, der andere am beweglichen Spiegel reflektiert wird. Beide Strahlen werden am Strahlteiler wieder vereint, wobei sie miteinander interferieren, und durch die Probe zum Detektor geführt werden. Die Interferenz der beiden Teilstrahlen ist hierbei von der Auslenkung des beweglichen Spiegels abhängig, wobei je nach Position des Spiegels andere Wellenlängen positiv oder negativ interferieren. Die spektrale Information ist daher im spiegelpositionsabhängigen Detektorsignal, dem sog. Interferogramm enthalten. Durch Fourier-Transformation des Interferogramms wird das IR-Spektrum des Detektorsignals, das sog. Einkanalspektrum berechnet. Aus den Einkanalspektren bei verschiedenen Proben oder Probenzuständen lassen sich gemäss dem Lambert-Beerschen Gesetz die Extinktionsspektren bzw. Differenzextinktionsspektren berechnen. Tabelle 2.5: Messparameter der FTIR-Spektrometer. Die Anzahl der Scans pro Spektrum und der zeitliche Ablauf der Messungen ist bei den jeweiligen Experimenten aufgeführt.

Parameter

Tensor27

IFS66

Vertex80V

Abtastrate Aufnahmemodus Auflösung Messbereich Blende Signalverstärkung Phasenauflösung Phasenkorrektur Zerofilling Apodisation Faltungsgrenze

20 kHz 160 kHz 80 kHz double sided forward backward 2 cm−1 4000 - 900 cm−1 4 - 5 mm (2 mm bei Aquaspec-Messungen) 2 - 4 (0 bei Aquaspec-Messungen) 16 cm−1 Mertz 4 Blackman-Harris 3-Term 5266 (15800 cm−1 bei Aquaspec-Messungen)

Fourier-Transform Infrarotspektrometer haben gegenüber dispersiven Geräten folgende Vorteile: Jaquinot-Vorteil Da bei der Verwendung eines Interferometers anstatt eines Gitters ein höherer Lichtfluss erreicht wird, ist die detektierte Stahlungsintensität höher, was zu einem besseren Signal-Rausch-Verhältnis führt.

31

2 Material und Methoden

Fellget bzw. Multiplexvorteil-Vorteil Alle Frequenzen werden zugleich gemessen, was die Messzeit für ein Spektrum erheblich reduziert. Connes bzw. Linearitätsvorteil-Vorteil Durch die parallele Verwendung eines Kalibrationslasers ist die Position des beweglichen Spiegels sehr genau bestimmbar, was zu einer hohen Wellenzahlgenauigkeit führt. Die in dieser Arbeit durchgeführten FTIR-Messungen wurden abhängig von der verwendeten Messtechnik und des benutzten Spektrometers mit den in Tab. 2.5 aufgeführten Parametern durchgeführt.

2.3.3 Attenuated total reflection FTIR-Spektroskopie Die Technik der abgeschwächten Totalreflektion (ATR) ist eine Art der Probenaufnahme, bei der der Infrarotstrahl innerhalb eines Medium mit hohem Brechnungsindex, dem internen Reflektionselement (IRE), reflektiert wird und die Probe in Kontakt mit dem IRE ist. An der Grenzfläche zwischen Probe und IRE, an der die Reflektion stattfindet, überlagern sich die „kommenden“ und die bereits reflektierten Strahlen und erzeugen so eine stehende Welle. Dieses elektromagnetische Feld existiert auch ausserhalb des IREs, wobei seine Intensität E mit steigendem Abstand z von der Oberfläche exponentiell abfällt (Gl. 2.4, Abb. 2.2). Abbildung 2.2: Schematische Darstellung des evaneszenten Feldes. Das evaneszente Feld an der Oberfläche des IREs wird durch die stehende Welle im Inneren des IREs hevorgerufen. Die Intensität des Feldes nimmt mit wachsendem Abstand von der Oberfläche exponentiell ab. Die Eindringtiefe dp (E = 37 %) beträgt bei Verwendung eines Ge-IREs, H2 O als Medium und einer Frequenz von 1140 cm−1 (= b 8,8 µm) 550 nm (siehe Abbildung). Zu beachten ist, dass die Wellenlänge vom Brechungsindex abhängt und daher im IRE λIRE = λ/n1 = 2,2 µm beträgt. (nach Goormaghtigh et al. (1999))

E = E0 · e−z/dp

(2.4)

32

2 Material und Methoden

Die Eindringtiefe dieses sog. evaneszenten Feldes in das Außenmedium, dp (depth of penetration) ist von den Brechungsindices des IRE (n1 ) und des Mediums (n3 ), dem Einstrahlwinkel (θ) und der Wellenlänge (λ) abhängig und ist definiert als der Abstand, bei dem die Amplitude auf ca. 37 % abgefallen ist. λ/n1

dp = 2π

q

sin2 θ

(2.5) 2

− (n3 /n1 )

In dieser Arbeit wurden vorwiegend Germanium-IREs (n1 = 4), H2 O als Medium (n3 = 1,33), und ein Einstrahlwinkel von 45 ° verwendet, was bei einer Frequenz von 1650 cm−1 (= b 6,06 µm) eine Eindringtiefe dp von 386 nm ergibt. Die Moleküle der Probe und des Mediums können durch das evaneszente Feld angeregt werden und somit IR-Strahlung absorbieren. Dies führt dazu, dass die absorbierten Frequenzen im Spektrum des reflektierten Strahls geringere Intensitäten aufweisen und bildet damit die Grundlage, die ATR-Technik in der Absorptionsspektroskopie zu nutzen. Die mit ATR-Technik erhaltenen Spektren können aufgrund der Nutzung des evaneszenten Feldes einige Unterschiede zu den in Transmission aufgenommenen Spektren aufweisen. Diese Unterschiede sind: normale Dispersion Für flüssige Proben oder Probenschichten, die dicker als das evaneszente Feld sind gilt, dass die Eindringtiefe das gemessene Probenvolumen und damit auch die Höhe der Absorption bestimmt. Da dp bei kleinen Wellenlängen geringer ist, besitzen z.B. Banden bei 1000 cm−1 (10 µm, dp = 638 nm) 1,65-fach höhere Absorptionen als Banden bei 1700 cm−1 (5,9 µm, dp = 386 nm). Dieser Effekt, normale Dispersion genannt, ist leicht durch Skalierung mit der wellenlängenabhängigen Funktion von dp zu korrigieren. anormale Dispersion Der Brechungsindex einer Probe ist im Bereich ihrer Absorptionsbanden nicht konstant, so ist er ist an der höherfrequenten Seite einer Absorptionsbande geringer als auf der niederfrequenten Seite. Da dp bei kleineren Brechungsindexes des Mediums geringer ist, führt dies zu verzerrten Absorptionsbanden mit vergrössertem niederfrequenten und verkleinertem höherfrequenten Anteil. Dieser Effekt lässt sich nur mit Kenntnis des wellenlängenabhängigen Brechungsindex der Probe oder durch die Kramers-Kroning-Transformation korrigieren (Fringeli et al. (2002); Goormaghtigh et al. (1999)).

33

2 Material und Methoden

Bei Schichtdicken von > 0,1 × dp und schwach absorbierenden Proben kann nach Harrick (1967) und Fringeli et al. (2002) die thin-film (Dünnfilm-) und weak absorber Approximation verwendet werden. Diese aus den Fresnelschen Gleichungen hergeleitete Vereinfachung besagt, dass die Probenabsorptionsbanden unabhängig vom Brechnungsindex der Probe sind. Dies bedeutet, dass Spektren von dünnen Schichten keine Verzerrungen aufweisen und daher mit Spektren aus Transmissionsmessungen verglichen werden können. Die in dieser Arbeit analysierten Proben wiesen Schichtdicken im Bereich von 10 nm auf und konnten daher mit der Dünnfilm-Approximation ausgewertet werden. Auch bei der Dünnfilm-Approximation muss jedoch der wellenlängenabhängige Brechungsindex des Mediums zur Berechnung verwendet werden, da es bei Überlagerungen von Absorptionsbanden der Probe (z.B. AmidI) und intensiven Banden des Mediums (z.B. δ(H2 O)) dennoch zu Verzerrungen von Probenbanden kommen kann. Diese Verzerrungen kommen zustande, da die Startintensität E0 des evaneszenten Feldes (Gl. 2.4) eine Funktion der Brechungsindices ist, wie im Folgenden weiter beschrieben wird.

2.3.4 Linearpolarisation Abbildung 2.3: Zusammenhang zwischen der Polarisation des evaneszenten Feldes (Ex , Ey ,Ez ) und der Polarisation der eingekoppelten IR-Strahlung (Epp , Evp ). Bei einem Einstrahlwinkel θ von 45 ° haben sowohl Ex auch Ez Anteile der Intensität von Epp , während Ey nur aus Evp resultiert. Anisotrope Proben (Zylinder in Abb.) weisen eine gleiche Ausrichtung in x- und y-Richtung auf.

Die Proben, die mit ATR-FTIR-Spektroskopie untersucht werden, häufig Proteine und Lipide, werden zumeist in mehreren Schichten oder einer Monolage auf der IRE Oberfläche immobilisiert. Innerhalb dieser Schichten besitzen die Probenmoleküle oft eine bestimmte molekulare Ausrichtung. Da die elektrischen Feldkomponenten des evaneszenten Feldes Ex , Ey und Ez unterschiedliche Intensitäten besitzen, das evaneszente Feld an sich also polarisiert ist, führt die unterschiedliche molekulare Ausrichtung der absorbierenden Dipolmomente zu unterschiedlichen Absorptionsbanden. Die orientierungsabhängige Absorption A ergibt sich durch

 A = k (M · E)2

(2.6)

34

2 Material und Methoden

wobei k eine Konstante, M (Mx , My , Mz ) der Vektor des betrachteten Übergangsdipolmoments und E (Ex , Ey , Ez ) die elektrischen Feldvektoren des evaneszenten Feldes ist (Marsh (1999)). Nach der Dünnfilm-Approximation werden die elektrische Feldkomponenten Ex , Ey und Ez mit n31 = n3 /n1 und n32 = n3 /n2 wie folgt berechnet (Harrick (1967); Fringeli et al. (2002)): p 2 cos θ sin2 θ − n231 p Ex = p 1 − n231 (1 + n231 ) sin2 θ − n231

(2.7)

2 cos θ Ey = p 1 − n231

(2.8)

Ez = p

2 cos θ sin θ − n232 p 1 − n231 (1 + n231 ) sin2 θ − n231

(2.9)

Im Falle der Dickfilm-Approximation, bei der die Probenschicht sehr viel dicker als das evanszenten Feld sein muss, können die Feldkomponenten in ähnlicher Weise berechnet werden, indem nur die Brechungsindices des Kristalls und der Probe berücksichtigt werden. Hierbei wird n3 in den Gleichungen 2.7, 2.8 und 2.9 durch n2 substituiert. Allerdings wird für die Auswertung nach der Dickfilm-Approximation wiederum die Kenntnis des wellenlängenabbhängigen Brechnungsindex der Probe benötigt. Da das evaneszente Feld an sich polarisiert ist, sind die Absorptionsbanden der Probenspektren aus einem Absorptionsanteil und einem Orientierungsanteil zusammengesetzt. Dies ist bei Verwendung von unpolarisierter IR-Strahlung zunächst ein gravierender Nachteil, eröffnet jedoch bei Verwendung von linearpolarsierter IR-Strahlung die Möglichkeit, sowohl das Spektrum als auch die Orientierung des Probenmoleküls zu ermitteln. Bei der polarisierten ATR-FTIR-Spektroskopie (PATR-FTIR) wird IR-Strahlung, die parallel zum Lot des IREs polarisisiert ist (Epp ), und solche die vertikal zum Lot polarisiert ist (Evp ) in das IRE eingekoppelt (Abb. 2.3). Die elektrischen Feldvektoren des evanszenten Feldes setzen sich in unterschiedlichem Maße aus der eingekoppelten Strahlung zusammen. So baut Strahlung in vp-Richtung nur die Ey -Komponente auf, während die Komponenten Ex und Ez beide aus Epp hervorgehen. Dadurch, dass die immobilisierten Moleküle gegenüber dem Lot des IREs rotationssymmetrisch sind, also Mx und My nicht zu unterscheiden sind, können Orientierungsinformationen aus den Einzelspektren App und Avp extrahiert werden.

35

2 Material und Methoden

Es werden im Folgenden drei Möglichkeiten beschrieben, Orientierungsinformationen aus polarisierten Spektren zu extrahieren. Es werden die Berechnung von orientierten Spektren, von dichroitischen Differenzspektren und Ordnungsparametern beschrieben.

2.3.4.1 Orientierte Spektren

Abbildung 2.4: Orientierte Spektren. Struktur- (a und c) und Orientierungsänderungen (b und d) haben beide Anteil am unpolarisiert gemessenen Spektrum (Aunpol ). Die orientierten Spektren enthalten nur spektrale Komponenten der Absorption in xy- und z-Richtung (Ax,y und Az ). Das isotrope Spektrum (Aiso ) enthält nur das Signal der Strukturänderung. Bei c und d sind die spektralen Anteile der beiden Schwingungsmoden A und E1 im AmidI- und AmidII-Bereich gezeigt (aus Lórenz-Fonfría et al. (2009))

Abb. 2.4 verdeutlicht die Auswirkung von Orientierungsänderungen (b und d) und Strukturänderungen (a und c) auf die unpolarisiert gemessenen ATR-Spektren (Aunpol , LórenzFonfría et al. (2009)). Durch die Berechnung von Spektren, die ausschliesslich der Absorption in xy- und z-Richtung entsprechen, ist der Orientierungseffekt gut von der Auswirkung der Strukturänderung zu trennen. Demgegenüber ist im Aiso -Spektrum nur Information über die Strukturänderung enthalten (Abb. 2.4). Die orientierten Spektren Ax,y , Az und Aiso ergeben sich aus den mit parallel und vertikal polarisierter Strahlung gemessenen Spektren App (ν) und Avp (ν) und den Feldkomponenten Ex ,Ey und Ez nach Gl. 2.10, 2.11 und 2.12. Hierbei steht f für die sog. Polarisatorineffizienz, die nach Gl. 2.20 berechnet wurde, und mit Hilfe derer die Spektren um

36

2 Material und Methoden

den technisch bedingt nie 100 %igen Polarisationsgrad korrigiert werden (Lórenz-Fonfría et al. (2009)). Ax,y =

Az =

Avp (1 − f ) − App f Ey2 (1 − 2f )

(2.10)

App (Ey2 (1 − f ) + Ex2 f ) − Avp (Ex2 (1 − f ) + Ey2 f ) Ey2 Ez2 (1 − 2f )

Aiso =

(Az + 2Ax,y ) 3

(2.11)

(2.12)

2.3.4.2 Dichroitische Differenzspektren Als experimentelles dichroitisches Verhältnis Rexp wird der Quotient der Absorption in pp und vp bezeichnet. Für eine isotrope Probe ist dieser Quotient lediglich von den Intensitäten der Feldkomponenten abhängig und wird dann Riso genannt (Gl. 2.13). Mit Kenntnis des Riso kann das dichroitische Differenzspektrum D∗ nach Fringeli et al. (2002) und Bechinger et al. (1999) mittels Gl. 2.14 berechnet werden. Ex2 + Ez2 Ey2

(2.13)

D∗ = App − Riso × Avp

(2.14)

Riso =

Das dichroitische Differenzspektrum entspricht bei isotroper Ausrichtung einer Nullline, bei Ausrichtung parallel zum Lot des IRE besitzt es positive und bei vertikaler Ausrichtung negative Banden.

2.3.4.3 Ordnungsparameter Der Ordnungsparameter S ist als ein Maß für die Orientierung in Bezug zu einer Referenzrichtung zu verstehen. Bei paralleler Ausrichtung nimmt S einen Wert von 1 an, bei Ausrichtung in einem Winkel θ von 90 ° ist S -0,5. Bei isotroper Orientierung oder Ausrichtung im magischen Winkel von θ = 54,7 ° ist S = 0. S=

3cosθ − 1 2

(2.15)

37

2 Material und Methoden

Der Ordnungsparameter eines Moleküls oder einer Molekülgruppe lässt sich experimentell aus dem dichroitischen Verhältnis Rexp mit Kenntnis der elektrischen Feldkomponenten Ex , Ey und Ez und des Winkels α zwischen dem Dipolvektor und der Molekülachse bestimmen.

S=

2(Ex2 − Rexp Ey2 + Ez2 ) (3 cos2 α − 1)(Ex2 − Rexp Ey2 + 2Ez2 )

(2.16)

Abbildung 2.5: Verschachteltes Ordnungsparametermodell. Der Winkel β zwischen der Molekülachse und dem Lot des IREs ist die zu ermittelnde Grösse. Die Winkel α, β und γ des Modells entsprechen jeweils einem Ordnungsparameter, das Produkt der Ordnungsparameter entspricht dem experimentell bestimmten Ordnungsparamter (verändert nach Goormaghtigh et al. (1999)).

Aus dem Anhand von Gl. 2.16 ermittelten Ordnungsparameter S kann durch Umformung von Gl. 2.15 die Molekülausrichtung als Winkel der berücksichtigten Gruppen gegen die IRE-Normale berechnet werden (Gl. 2.17). r θ = arccos

2S + 1 3

(2.17)

Da der Ordnungsparameter eine Ausrichtungsverteilung gegenüber dem Messkoordinatensystem darstellt, sich zwischen den interessierenden Molekülgruppen und dem IRE jedoch zumeist eine Lipidmembran befindet, deren Ordnung auch durch perfekte Anordnung des Proteins nicht „überboten“ werden kann, wird ein verschachteltes sog. nested

38

2 Material und Methoden

Modell verwendet (Gl. 2.18, Abb. 2.5, Rothschild und Clark (1979); Goormaghtigh und Ruysschaert (1990)). S = SM embran SStruktur SDipol

(2.18)

2.3.4.4 Oberflächenkonzentration Oft wird in ATR-FTIR-spektroskopischen Experimenten die Probe in situ durch Adsorption an die Oberfläche des IREs präpariert. Das bedeutet, dass die Probenkonzentration, anders als bei Transmissionsexperimenten zunächst nicht bekannt ist. Da jedoch oft erst die genaue Kenntnis des Probenzustand die Interpretation der Ergebnisse erlaubt, wird in ATR-Experimenten die Oberflächenkonzentration der Probe berechnet. Die Oberflächenkonzentration Γ ist als Projektion der Volumenkonzentration innerhalb des evaneszenten Feldes – skaliert mit der abstandsabhängigen Feldstärke (E(z)) – auf die Fläche des IRE zu verstehen. Die Berechnung von Γ erfolgt analog zum Lambert-Beerschen Gesetz aus der Extinktion, wobei meist die Bandenfläche (A) verwendet wird, dem Extinktionskoeffizienten und der Schichtdicke (d). Die Schichtdicke eines ATR-Experiments korreliert mit der Eindringtiefe des evaneszenten Feldes multipliziert mit der Anzahl der internen Reflektionen (N). Der Anteil der Eindringtiefe kann hierbei wiederum mit Kenntnis der Brechnungsindices des IREs (n1 ) und der Probe (n2 ) und der Feldkomponenten (Ex ,Ey ,Ez ) berechnet werden. Damit lässt sich die Oberflächenkonzentration für eine isotrope Probe nach der Dünnfilm-Approximation nach Gl. 2.19 berechnen (Tatulian (2003)). Γ=

App n12 cos θ Avp n12 cos θ = 2 2 nR N (Ex Ez ) nR N (Ey2 )

(2.19)

Die in dieser Arbeit verwendeten Exinktionskoeffizienten, die Anzahl der internen Reflektionen, sowie alle anderen Parameter sind in Tab. 2.6 aufgelistet. Die Anzahl der einzuberechnenden Gruppen nR richtet sich danach, worauf sich der jeweilige Extinktionskoeffizient bezieht. Aus der Formel der Oberflächenkonzentration wird deutlich, dass die Schichtdicke in einem ATR-Experiment durch das Material des IREs, den Einstrahlwinkel und die Anzahl der internen Reflektionen sehr gut definiert ist. Die Schichtdicke der Probe ist bei IR-Messungen mit wässigen Lösungen ein wichtiger Parameter, da H2 O im Bereich der AmidI-Bande eine starke Absorption aufweisst, die bei Schichtdicken ab ca. 10 µm zur

39

2 Material und Methoden

Totalabsorption führt. Jedoch steigt auch das Probensignal linear mit der Anzahl der internen Reflektionen, und bei der Dickfilm-Konfiguration auch linear mit der Eindringtiefe, so dass sich ein Optimum zwischen zu wenig Signal und Übersättigung durch die H2 O-Absorption ergibt. Dieses Optimum kann durch die Wahl der o.g. Parameter in einem ATR-Experiment hervorragend erreicht werden.

2.3.5 Polarisatorineffizienz Der Polarisationsgrad eines realen Versuchsaufbaus ist abhängig vom verwendeten Polarisator und der Geometrie des Strahlenganges, und daher niemals 100%ig. Zwar hat der Polarisationsgrad einen Einfluss auf die Berechnung der Oberflächenkonzentration (Gl. 2.19), der Ordnungsparameter (Gl. 2.16), des Riso (Gl. 2.13) und der orientierten Spektren (Axy , Az und Aiso , Gl. 2.10, 2.11, 2.12), kann aber für den jeweiligen Aufbau bestimmt und zur Korrektur verwendet werden. Nimmt man einen Polarisationsgrad von 100 % an, ergibt sich für den Riso einer isotrope Probe bei Dickschicht-Approximation ein Wert von 2. Daher kann aus dem experimentell bestimmten Risoexp , dem Einstrahlwinkel θ und den Brechungsindices von IRE und Medium (n1 und n3 ) die sog. Polarisatorineffizienz bestimmt werden (Lórenz-Fonfría et al. (2009)).

f=

n23 (Risoexp − 1) − [Risoexp (n23 + n21 ) − 2n21 ] sin2 θ [Risoexp (n21 − n23 ) − n23 ] sin2 θ + n23

(2.20)

Die Polarisatorineffizienz des in dieser Arbeit verwendeten Aufbaus (siehe 2.4) wurde experimentell bestimmt. Hierzu wurden für eine komplette Polarisatorumdrehung um 360 ° in 1 ° Schritten Absorptionsspektren einer Natriumazidlösung (10 mM NaN3 in A. dest) aufgenommen. Anschliessend wurde die N3 -Absorptionsbande bei 2049 cm−1 (Abb. 2.6A) integriert und das normierte Integral gegen den Winkel aufgetragen (Abb. 2.6B). Der Maximalwert wurde als 0 ° bzw. pp definiert, der Minimalwert bei 90 ° entspricht vp. Damit ergibt sich ein Risoexp von δApp /δAvp = 0,99/0,51 = 1,94 ± 0,01. Mit diesem Wert für Risoexp , einem θ von 45 ± 2 °, n1 = 4 ± 0,1 und n2 = 1,32 ± 0,06 wurde nach Gl. 2.20 eine Polarisatorineffizienz des verwendeten Aufbaus von f = 0,034 ± 0,008 bestimmt. Da die Polarsatorineffizienz für den jeweiligen Aufbau konstant ist, können nach einmaliger Ermittlung von f die idealen, korrigierten Werte für AppIdeal und AvpIdeal aus den

40

2 Material und Methoden

Abbildung 2.6: Polarisatorineffizienz des verwendeten Aufbaus. A: Absorptionsspektren von Natriumazid (10 mM NaN3 ), das als isotrope Probe verwendet wurde bei 0 ° und 90 ° Polarisation. B: Integrale der N3 -Bande aufgetragen gegen den Polarisatorwinkel. Der Winkel mit der grössten Absorption wurde als 0 ° bzw. pp definiert, der mit der geringsten Absorption entspricht 90 ° bzw. vp.

Messwerten App und Avp berechnet werden. Der Unterschied zwischen den gemessenen und den idealen Werten lag bei 3 %. AppIdeal = (App + f AvpIdeal )/(1 − f )

(2.21)

AvpIdeal = (Avp + f AppIdeal )/(1 − f )

(2.22)

2.3.6 Berechnungen In dieser Arbeit wurden die Dichroitischen Differenzspektren (D∗ , 2.3.4.2), Ordnungsparameter (S, 2.3.4.3), Oberflächenkonzentrationen (Γ, 2.3.4.4) und Orientierte Spektren (Ax,y , Az , Aiso , 2.3.4.1) mit einem eigens programmierten Perl-Skript berechnet. In diesem Skript wurden alle o.g. Formeln in Unterroutinen implementiert und je nach Art der Berechnung hintereinander aufgerufen. Im Folgenden wird der Ablauf der verschiedenen Berechnungen erklärt: D∗

Feldkomponenten mit Gl. 2.7, 2.8 und 2.9 berechnet → Ergebnis zur Berechnung von Riso in Gl. 2.13 eingesetzt → f mit Gl. 2.20 berechnet und die Extinktionswerte zur Korrektur in Gl. 2.21 und 2.22 eingesetzt → Korrigierte Extinktionen und Riso in Gl. 2.14 eingesetzt; Berechnung für jeden Extinktionswert des Spektrums mit wellenzahlabhängigem n3 ; Keine Fehlerrechnung.

41

2 Material und Methoden

S

Feldkomponenten mit Gl. 2.7, 2.8 und 2.9 berechnet → f mit Gl. 2.20 berechnet und integrierte Extinktionen zur Korrektur in Gl. 2.21 und 2.22 eingesetzt → Korrigierte integrierte Extinktionen und Feldkomponenten in Gl. 2.16 eingesetzt; Alle Parameter mit Standardabweichung eingesetzt; Fehlerrechnung mit Monte Carlo Methode.

Γ

Feldkomponenten mit Gl. 2.7, 2.8 und 2.9 berechnet → f mit Gl. 2.20 berechnet und integrierte Extinktionen zur Korrektur in Gl. 2.21 und 2.22 eingesetzt → Feldkomponenten und korrigierte integrierte Extinktionen in Gl. 2.19 eingesetzt; Alle Parameter mit Standardabweichung eingesetzt; Fehlerrechnung mit Monte Carlo Methode.

Ax,y , Az , Aiso Feldkomponenten mit Gl. 2.7, 2.8 und 2.9 berechnet → f mit Gl. 2.20 berechnet und integrierte Extinktionen zur Korrektur in Gl. 2.21 und 2.22 eingesetzt → Feldkomponenten und f in Gl. 2.10, 2.11 und 2.12 eingesetzt; Berechnung für jeden Extinktionswert des Spektrums mit wellenzahlabhängigem n3 ; Keine Fehlerrechnung. Bei der Berechnung von Γ und S wurde eine Fehlerrechnung nach der Monte Carlo Methode durchgeführt (Metropolis und Ulam (1949); Lórenz-Fonfría et al. (2009)). Diese Methode basiert darauf, dass für jede Eingangsgrösse der Berechnung entsprechend ihrem Wert und ihrer Standardabweichung normalverteile Zufallswerte, sog. Realisationen generiert werden. Diese Realisationen werden anstatt der Eingangsgrössen in die Berechnung eingesetzt, wodurch sich nach vielfachem Wiederholen dieser Prozedur eine Normalverteilung der Ergebnisse ergibt. Das Endergebnis der Rechnung entspricht daher dem Mittelwert und der Standardabweichung der berechneten Verteilung. Diese Methode zur Fehlerberechnung erspart das partielle Ableiten des Gleichungssystems und ermöglicht so die flexible Kopplung der einzelnen Unterroutinen. Die Monte Carlo-Methode wurde ebenfalls als eine Unterroutine in das o.g. Perl-Skript implementiert und so angewandt, dass zuerst von allen Eingangsgrößen Realisationen berechnet wurden, die dann den jeweiligen Unterroutinen zur Ergebnisberechnung übergeben wurden. Dieser Ablauf wurde 105 mal wiederholt, was auf einem Desktopcomputer (Intel Core 2 Duo, 2,53 GHz) ca. eine Sekunde dauerte. Der verwendete AmidII-Extinktionskoeffizient wurde anhand von BSA- und Lysozymlösungen bekannter Konzentrationen durch Transmissionsmessung unter Verwendung der Aquaspec-Zelle bestimmt (2.5). Die Konzentrationen der Proteinlösungen wurden zuvor anhand der E280 und publizierten Extinktionskoeffizienten (Venyaminov und Prendergast

42

2 Material und Methoden

Tabelle 2.6: Verwendete Extinktionskoeffizienten und Brechungsindices

Name

Bereich (cm−1 )

Wert

SD

Quelle

3,47×107 1,32×105 9,5×106

6,94×104 1,32×103 2,9×105

a

1,43 1,45 4,035 4,012 1,321 1,417 1,274 1,347

0,14 0,05 0,003 0,001 0,142 0,013 0,011 0,011

Extinktionskoeffizienten (cm/mol) ν(OH) ν(CH) AmidII

3760 - 2990 2990 - 2812 1600 - 1485

b c

Brechungsindices Lipid Protein Ge-IRE H2 O

a

b c

d e

4000 1800 3760 2990 1780 1600

-

2800 1400 2990 2812 1705 1485

b d e e a a a a

Max und Chapados (2009), berechnet anhand des publizierten H2 OSpektrums und der Extinktionskoeffizienten. Tatulian (2003), Die SD wurde mit 1 % angenommen. Der AmidII-Extinktionskoeffizient wurde mit Proteinlösungen bekannter Konzentrationen selbst ermittelt (siehe Text). Reiter et al. (2004) Frey et al. (2006)

(1997)) bestimmt. Die Schichtdicke der Aquaspec-Zelle wurde anhand der Extinktion der H2 O-Biegeschwingung und des publizierten Extinktionskoeffizienten auf 6,8 ± 0,2 µm bestimmt (Max und Chapados (2009)). Weitere in den Berechnungen verwendete Werte waren die Anzahl der internen Reflektionen des IRE von 12±1. Ein IRE mit den Maßen 52×2×20 mm und 45 ° hat theoretisch 13 Reflektionen, durch den Silikonspacer fehlt jedoch die Fläche von ca. einer Reflektion. Die Anzahl der Residuen (nR ) des lipidiertem Ras ist 189.

2.4 Neue Messaufbauten 2.4.1 Ventrobot Das verwendete Durchflusssystem bestand bei Beginn der Arbeit lediglich aus der ATRKüvette inkl. Schlauch und einer Schlauchpumpe. Um die Reproduzierbarkeit und die

43

2 Material und Methoden

Abbildung 2.7: Verwendetes Messsystem. Das Durchflusssystem bestand aus der ATR-Küvette, einer Schlauchpumpe (P), der Ventilsteuerung „Ventrobot“ und fünf Reservoiren (A-E). Über Ventrobot wurden die acht Drei-Wege-Magnetventile des Durchflusssystems angesteuert. Polarisierte Messungen wurden mit der Polarisatorautomatisierung „Dichrobot“ durchgeführt. Die Pumpe, Ventrobot und Dichrobot wurden über die serielle Schnittstelle aus dem Messprogramm OPUS heraus angesteuert.

Ausfallsicherheit der Experimente zu erhöhen, wurde das automatisiertes Durchflusssystem „Ventrobot“ entwickelt (Abb. 2.7). Ventrobot wird über die serielle Schnittstelle durch das Messprogramm OPUS angesteuert und ermöglichte es, zuvor unmögliche Messabläufe zu realisieren, wie z.B. der Wechsel zwischen mehreren Lösungen im Minutentakt über Nacht. Ausserdem ist es mit diesem System möglich, zwei beliebige der fünf ankoppelbaren Lösungen (A - E) im Durchfluss in beliebigen Mischungsverhältnissen zu mischen (1 % Schritte von 10 - 90 %). Die Mischung von zwei Lösungen wird hierbei durch Pulsweitenmodulation (PWM) mit einer minimalen Öffnungszeit der verwendeten Magnetventile von 100 ms erreicht. Die Linearität dieses Verfahrens wurde

44

2 Material und Methoden

durch Mischung einer 10 mM NaN3 -Lösung mit A. dest nachgewiesen (Abb. 2.8). Desweiteren kann der Aufbau auch im zirkulierenden, statt im Durchfluss-Modus betrieben werden, was Proteinanlagerungsexperimente ermöglicht, für die ansonsten einige 100 ml Proteinlösung gebräucht würden.

Abbildung 2.8: Linearität der Mischung mit Ventrobot mittels Pulsweitenmodulation (PWM). A: Kinetiken der Bandenfläche der N3 -Bande von Natriumazid in A. dest bei verschiedenen Mischungsverhältnissen. Die Mischung wurde im Durchfluss durch PWM an Ventil 1 (siehe Abb. 2.7) erreicht. B: Bandenfläche der N3 -Bande aufgetragen gegen die eingestellte N3 -Konzentration. Die Methode der PWM ermöglicht ein über einen großen Mischbereich lineares Mischungsverhältnis.

2.4.2 Dichrobot Ein weiterer Aufbau, der im Rahmen dieser Arbeit entwickelt wurde, ist eine Polarisatorautomatisierung, der sog. „Dichrobot“. Das Gerät fährt einen KRS-5-Goldgitterpolarisator in den Strahlengang oder aus dem Strahlengang heraus und dreht den Polarisator mit einer Winkelauflösung von 0,25 °. Auch dieser Aufbau wird über die serielle Schnittstelle über das Messprogramm OPUS angesteuert. Ventrobot und Dichrobot wurden in der Feinmechanikwerkstatt der Fakultät für Biologie von Christoph Pinske gebaut. Die zur Ansteuerung der Ventile und Schrittmotoren notwendige Elektronik wurde von Harald Chorongiewski (LS für Biophysik, Ruhr Universität Bochum) entworfen und gebaut.

45

2 Material und Methoden

2.5 Transmissions FTIR-Spektroskopie von Proteinen in Lösung Die Messungen von Proteinen in Lösung wurden mit der Aquaspec-Zelle durchgeführt. Die Aquaspec-Zelle ist eine Durchflusszelle, die aus zwei im Abstand von 6 µm verklebten Calciumfluoridfenstern besteht. Der Hohlraum fasst 1 µl und kann über eine Hamiltonspritze beladen werden. Theoretisch lässt sich das interne Volumen der Zelle durch Injektion von 10 µl Probenvolumen komplett austauschen. In der Praxis werden jedoch mindestens 40 µl benötigt, da beim Herausziehen der Spritze oftmals Luft in den vorgelagerten Filter gerät, die zunächst durch die Zelle gespült werden muss. Die Aquaspec-Zelle ist über einen Schlauchanschluss mit einen Kryostaten temperierbar; alle Messungen wurden bei 20 °C durchgeführt. Abbildung 2.9: Aquaspec-Zelle. Die Durchflusszelle wird mit einer Hamiltonspritze beladen. Ein vollständiger Flüssigkeitsaustausch ist mit 10 µl Volumen möglich. A: Aquaspec-Zelle von vorne, aus Richtung des Strahlengangs B: schematische Seitenansicht der Aquaspec-Zelle. (aus Ollesch (2006))

Für die Messungen mit der Durchflusszelle wurden alle Puffer und wenn möglich auch Proteinlösungen entgast und die Zelle vor der Messung mindestens 10 × mit 50 µl Puffer gespült.

2.6 Sekundärstrukturanalyse mit FTIR-Spektroskopie 2.6.1 Grundlagen Infrarotspektren von Proteinen weisen mehrere Banden auf, die charakteristisch für die Absorptionen des Proteinrückgrats sind. Diese sog. Amid-Banden (AmidA, AmidB und AmidI - V) resultieren aus unterschiedlichen, gekoppelten Schwingungsmoden der Peptidgruppe, wobei die grössten Banden die AmidI- und AmidII-Bande sind. Die AmidI-Bande

46

2 Material und Methoden liegt zwischen 1700 und 1600 cm−1 und wird zu 76 % durch die C=O-Streckschwingung, zu 14 % durch die CN-Streckschwingung und zu 10 % durch die CCN-Deformationsschwingung verursacht. Die AmidII-Bande, die zwischen 1600 und 1500 cm−1 liegt, wird durch fünf Schwingungsmoden hervorgerufen, von denen die NH-Biegeschwingung (43 %) und die CN-Streckschwingung (29 %) den grössten Anteil haben (Krimm und Bandekar (1986)). Da alle Amid-Banden durch Absorptionen der Peptidgruppe hervorgerufen werden, führen unterschiedliche Sekundärstrukturen zu unterschiedlichen Absorptionsfrequenzen. In den meisten Publikationen wird jedoch die AmidI-Bande zur Bestimmung von Sekundärstrukturanteilen analysiert, da sie eine hohe Intensität aufweist und zum größten Teil nur durch eine Schwingungsmode verursacht ist. Desweiteren ist diese Bande kaum von Absorptionen der Aminosäureseitenketten überlagert und wenig von unterschiedlichen Lösungsbedingungen abhängig, was eine vom Probenzustand nahezu unabhängige Analyse ermöglicht. Tabelle 2.7: AmidI-Frequenzen der häufigsten Sekundärstrukturen. Die gezeigten Werte sind Richtwerte und stammen aus Jackson und Mantsch (1995) sowie Arrondo et al. (1993) und stimmen mit den von Goormaghtigh et al. (1994b) zusammengestellten Werten ± 3 cm−1 überein.

Sekundärstruktur

AmidI-Frequenz / cm−1

Antiparalleles β-Faltblatt - Aggregierte Stränge Turns α-Helix Random Coil β-Sheet Aggregierte Stränge

1675 - 1695

a

1660 1648 1652 1625 1610

-

1685 1660 1660 (deuteriert: 1640 - 1648)a 1640 1628

Bei Inkubation von Proteinen in deuterierten Puffern tauschen die lösungsmittelexponierten Gruppen zuerst von H nach D aus.

Die Hauptabsorption der AmidI-Bande wird durch die C=O-Schwingung der Peptidgruppe hervorgerufen, die ohne Interaktion mit dem Rest des Rückgrats bei ca. 1666 1670 cm−1 absorbieren würde (Tatulian (2003); Jackson und Mantsch (1995)). Diese Frequenz wird durch die Ausbildung der jeweiligen Sekundärstrukturen so moduliert, dass sich die verschiedenen Absorptionsfrequenzen der einzelnen Sekundärstrukturelemente ergeben. Den größten Anteil an der niederfrequenten Verschiebung der Bande (z.B. bei Helix und Faltblatt) hat die Kopplung der Übergangsdipolmomente der einzelnen COGruppen (Torii und Tasumi (1992)). Diese Kopplung ist von der räumlichen Nähe und dem Winkel zwischen den CO-Gruppen abhängig und wird zu einem geringen Anteil auch

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2 Material und Methoden

durch die H-Brücken und kovalenten Bindungen beeinflusst (Brauner et al. (2005)). Ausserdem führen H-Brücken zwischen der CO-Gruppe und den Peptid-NH-Gruppen, dem Lösungsmittel oder anderen H-Brückendonoren zu einer Verringerung der Kraftkonstanten der C=O-Bindung und damit zu einer Verschiebung der Absorption zu niedrigeren Frequenzen. Eine Verschiebung der Absorption zu höheren Frequenzen (z. B. bei Turn) kann durch sterische Behinderung der Tautomerie der Peptidgruppe erklärt werden, bei der es zu einer zu einer Verschiebung in Richtung reiner C=O-Doppelbindung kommt (Jackson und Mantsch (1995)).

Abbildung 2.10: Schematische Darstellung der Bandenzerlegung. Unterschiedliche Sekundärstrukturen besitzen Absorptionsmaxmima bei unterschiedlichen Frequenzen innerhalb der AmidI-Bande. Die Anteile der einzelnen Sekundärstrukturen entsprechen den Flächen der jeweiligen Glockenkurven. Die Zuordnung der Sekundärstrukturen zu den Frequenzen der Glockenkurven erfolgt anhand von Literaturwerten (Goormaghtigh et al. (1994b)).

Die Sekundärstrukturabhängigkeit der Absorptionsfrequenz wurde in dieser Arbeit genutzt, um die Sekundärstruktur des Proteins Ras in verschiedenen Probenzuständen zu analysieren. Die hierzu verwendete Methode der Bandenzerlegung beruht darauf, die AmidI-Bande in einer least squares-Anpassung durch eine Summe von Glockenkurven zu beschreiben (Byler und Susi (1986)). Das Ergebnis der Anpassung sind die Positionen (Frequenzen) und Flächen der einzelnen Glockenkurven, wobei anhand der Positionen zusammen mit Literaturwerten jeder Glockenkurve eine Sekundärstruktur zugewiesen werden kann. Hierbei entspricht die Fläche der Kurven im Verhältnis zur Gesamtfläche

48

2 Material und Methoden

aller Glockenkurven dem Anteil der einzelnen Sekundärstruktur an der Gesamtsekundärstruktur. Da die Auswertung mittels Bandenzerlegung erheblich von den Startwerten und constraints der Anpassung abhängt, wurde von Goormaghtigh et al. (1994b) eine objektive Methode der Zerlegung erarbeitet. Diese Methode wurde auch in dieser Arbeit eingesetzt und ist im Folgenden ausführlich beschrieben.

2.6.2 Spektrenvorbereitung Die Prozessierung der Spektren und die nachfolgende Bandenzerlegung wurde mit dem Programmpaket „Kinetics“ (Prof. Erik Goormaghtigh, ULB Brüssel) durchgeführt. Das Programm basiert auf der Mathematiksoftware-Umgebung Matlab (The Mathworks Inc.) und wurde dem LS für Biophysik von Prof. Goormaghtigh freundlicherweile zur Verfügung gestellt. Zunächst wurden die Proteinspektren einer Wasserdampfkorrektur unterzogen, bei der Dampfspektren benutzt wurden, die an der selben Probe aufgenommen wurden. Die Korrektur wurde mit dem Programm OPUS manuell durchgeführt, wobei die H2 O-Dampfbanden im Bereich von 1800 bis 1700 cm−1 (als Markerregion für den Gesamtwasserdampf) durch skalierte Subtraktion eliminiert wurden. Anschliessend wurden die Spektren durch Apodisation mit einer Gauss-Funktion der Halbwertsbreite 4 cm−1 geglättet und ein berechnetes Seitenkettenabsorptionsspektren subtrahiert. Das Seitenkettenspektrum wurde durch „Kinetics“ anhand von Literaturdaten (Barth (2000)) als Linearkombination von einzelnen Aminosäurespektren berechnet. Hierzu musste die jeweilige Anzahl der im AmidI- und AmidII-Bereich absorbierenden Aminosäuren, deren Deuterierungsgrad und der pD-Wert des Puffers angegeben werden. Das Seitenkettenspektrum wurde von der Software automatisch anhand der Tyrosin-Ringschwingung bei ca. 1515 cm−1 auf das Absorptionsspektrum des Proteins skaliert und davon subtrahiert.

2.6.3 Bandenzerlegung Die Startpositionen für die Bandenzerlegung wurden mittels 2. Ableitung mit zusätzlicher Glättung um 4 cm−1 und durch Fourier-Selbstentfaltung (FSD, Fourier Self Deconvolution) ermittelt, wobei die FSD mit Bandenbreiten von 13,6 cm−1 (Lorentz) und 30 cm−1 (Gauss) berechnet wurde. Vor der Bandenzerlegung wurden die Spektren zwischen 1700 und 1600 cm−1 basislinienkorrigiert und auf eine AmidI-Bandenfläche von

49

2 Material und Methoden

eins normiert. Als Startpositionen der Zerlegung wurden die Minima der zweiten Ableitung sowie die Maxima der Fourier-Selbstentfaltung verwendet. Andere Startwerte wie die Bandenbreite und das Verhältnis von Lorentz- zu Gauss-Glockenkurve wurden mit Literaturwerten initialisiert. Die Zerlegung wurde mit vier Banden und unterschiedlichen Startpositionen begonnen. In einem iterativen Verfahren wurde der Startparametersatz der Zerlegung (Position, Bandenbreite, Formfaktor (Gauss-Lorentz-Anteil) und Intensität) so variiert, dass sowohl die Standardabweichung der Anpassungen, als auch die Wurzel der summierten quadratischen Abweichungen (root mean square deviation, RMSD) zur 3D-Struktur minimiert wurde. Der RMSD-Wert wurde nach v u i=1 u1 X RMSD = t δi2 , N

(2.23)

i=N

mit der Anzahl N der Sekundärstrukturelemente und der Differenz δ zwischen dem Ergebnis der Bandenzerlegung und der 3D-Struktur berechnet. Die Sekundärstrukturanteile der 3D-Struktur wurden mit dem Programm STRIDE (Frishman und Argos (1995)) ermittelt. Der so auf die 3D-Struktur von Ras kalibierte Parametersatz wurde zur Bandenzerlegung der AmidI-Bande des membrangebundenen lipidierten Ras verwendet. Diese Zerlegung entsprach daher einer Intensitätsanpassung der Komponentenbanden und brachte damit den Vorteil einer direkten Vergleichbarkeit der Sekundärstruktur von membrangebundenem Ras und Ras in Lösung.

2.7 Globale Anpassung von 3D-Spektren mit MCR-ALS Die multivariate Kurvenanpassung mit alternating least squares Optimierung (MCRALS) wurde in dieser Arbeit verwendet, um Artefakte aus 3D-Differenzspektren zu filtern. Da die Differenzsignale von Proteinmonolagen sehr gering sind, haben Störungen wie Basisliniendrifts, Banden des Silikonspacers, Schwankungen der Wasserbandenintensität oder der Wasserdampfbanden erhebliche Auswirkungen auf die Differenzspektren. Da jedoch alle diese Störspektren zeitliche Verläufe besitzen, die unabhängig von dem Verlauf des jeweiligen Proteindifferenzspektrums sind, können sie durch eine multivariate Datenauswertung vom Proteinspektrum getrennt werden. Die Kernidee der multivariaten Datenanalyse ist es, einen dreidimensionalen Datensatz z. B. ein zeitaufgelöstes

50

2 Material und Methoden

Spektrum Dλ,t durch eine Summe von n Produkten von Komponentenspektren Sλ,k und Konzentrationsprofilen Ck,t zu beschreiben (Gl. 2.24, Abb. 2.11, Jaumot et al. (2004)).

Dλ,t =

n X

Ck,t Sλ,k + Rλ,t

(2.24)

k=1

Hierbei ergibt die Multiplikation einer Spektrenkomponente mit ihrem Konzentrationsprofil ein 3D-Spektrum, dass nur dieser Komponente entspricht. Bei Subtraktion aller ermittelten Komponenten-3D-Spektren von den Rohdaten bleibt somit bei optimaler Datenanpassung nur das 3D-Spektrum des Rauschens (Rλ,t ) über. Das Ergebnis einer solchen Auswertung besteht also aus den puren Spektren und Konzentrationsverläufen jeder Einzelreaktion.

Abbildung 2.11: Prinzip der MCR: Die Datenmatrix kann durch die Summe von n Produkten von Konzentrationsprofilen und Komponentenspektren und einer Residualmatrix, die das Rauschen der Messung enthält beschrieben werden.

MCR-ALS ist eine sog. soft modeling Methode, da keine physikalischen Modelle der ablaufenden Reaktionen für die Anpassung vorgegeben werden müssen. Dies ermöglicht die Analyse von Daten, deren zugrundeliegenden Reaktionen noch unbekannt sind oder die wie die hier bearbeiteten Störsignale keinen erkennbaren Zusammenhang zu den experimentellen Parametern haben. Allerdings sind die berechneten Ergebnisse nicht eindeutig und die Stabilität der Ergebnisse kann nur durch Variation der Startparameter getestet werden. Es besteht jedoch die Möglichkeit verschiedene Bedingungen (constraints) zu setzen, um den Variationsraum der anzupassenden Parameter zu verkleinern und so zu einem eindeutigeren Ergebnis zu gelangen. Folgende constraints können u.A. angewendet werden:

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2 Material und Methoden

Non-negativity Die Komponentenspektren oder Konzentrationsprofile besitzen keine negativen Werte. Dies gilt z. B. bei Spektren, die gegen einen nicht absorbierenden Hintergrund gemessen wurden. Unimodality Die Komponentenspektren besitzen nur eine Bande bzw. die Konzentrationsprofile nur ein Konzentrationsmaximum. Diese Bedingung ist z. B. für Elutionsverläufe von Chromatographien gültig. Closure Die Summe der Einzelkonzentrationen bleibt während der Reaktion konstant, was z. B. aufgrund der Massenbilanz für geschlossene Systeme gilt. Da die MCR-ALS-Auswertung mit einer zu grossen Anzahl von Startkomponenten zu einer Überanpassung der Daten führen kann (overfit), wurde die Anpasung mit einer unterschiedlichen Anzahl von Komponenten durchgeführt. Die Ergebnisse der verschiedenen Anpassungen wurden nach folgenden Kriterien beurteilt: • Die charakteristischen Banden des Proteindifferenzspektrums sollten nur in dem jeweiligen Spektrum vorkommen und nicht durch mehrere Spektren beschrieben sein. Dazu gehört auch, dass die berechneten Spektren keine vorzeichenvertauschten Kopien voneinander sein sollten. Hierzu wurden die Spektren jeweils untereinander und mit bekannten Spektren verglichen. • Die berechneten Konzentrationsprofile sollten die Differenzextinktionssignale, deren Verlauf schon in den Rohdaten zu erkennen waren, zumindest reproduzieren. • Geringes Rauschen im Proteindifferenzspektrum und in der dazugehörigen Kinetik. • Statistische Kriterien für eine gelungene Anpassung der Daten sind die Standardabweichung und das Bestimmtheitsmass (R2 ) der Anpassung. Zur MCR-ALS-Auswertung wurde das Matlabprogramm „als2004“ (Jaumot et al. (2005)) verwendet und die Auswertung wenn nicht anders beschrieben nach folgendem Schema durchgeführt: 1. Zusammenstellen einer Rohdatenmatrix, spektrale Regionen mit hohem Rauschanteil werden verworfen, die Spektren werden einer linearen Basislinienkorrektur oder einer Offset-Korrektur unterzogen.

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2 Material und Methoden

2. Extraktion von Differenzextinktionsverläufen bzw. Kinetiken bekannter Banden von eindeutig zuzuordnenden Zuständen/Prozessen (z.B. Wasserdampf, Hydrolyse). Diese Verläufe werden als Startkonzentrationsprofile verwendet. Zusätzlich werden bis zu sechs Startkonzentrationsprofile aus Zufallszahlen erstellt, die in der Anpassung sukzessive hinzugegeben werden. 3. Es werden keine Constraints gesetzt; die maximale Zahl der Iterationen wird auf 500, und das Konvergenz-Kriterium auf 10−7 gesetzt. Die Daten wurden nicht normiert. 4. Zunächst Berechnung der zu den Startwerten passenden Spektren, indem C nicht variiert und S mit der least squares-Methode an die Daten D angepasst wird. 5. Fixierung der berechneten Spektren S, Anpassung von C und Berechnung des Fehlers zu D 6. Die abwechselnde Anpassung der Spektren und Konzentrationsprofile (Schritt 4 und 5) erfolgt, bis der vorgegebene Fehler unterschritten wird oder sich in 20 Iteration nicht verringert hat. 7. Falls das Ergebnis nicht die Kriterien für eine gelungene Anpassung erfüllt (s.o.), wird die Anpassung erneut mit einer zusätzlichen Komponente gestartet.

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3 Ergebnisse und Diskussion 3.1 Herstellung einer festkörpergestützten Lipidmembran 3.1.1 Einleitung Zur ATR-FTIR-Spektroskopischen Untersuchung von membranverankertem Ras musste zuerst ein geeignetes Messsystem etabliert werden, das die Untersuchung des Proteins in Lipidmembranumgebung ermöglicht. Hierzu wurde die Methode der Vesikelspreitung verwendet, die es ermöglicht, eine festkörpergestützte Lipidmembran auf dem internen Reflektionselement (IRE) zu generieren. Diese Methode beruht darauf, dass kleine unilammelare Vesikel (SUVs, small unilammelar vesicles) beim Kontakt mit hydrophilen Oberflächen platzen und einen Lipidbilayer auf der Oberfläche ausbilden. Obwohl diese recht simpel erscheinende Methode seit Mitte der 1980er Jahre Forschungsgegenstand ist, ist sie noch nicht komplett verstanden (Brian und McConnell (1984), Richter et al. (2006)). Grund dafür ist, dass die Vesikelspreitung von vielen Parametern beeinflusst wird, deren quantitativer Einfluss zumeist unbekannt ist. Tendenziell führen z.B. kleine Vesikel (kleiner 100 nm Durchmesser), hohe Vesikelkonzentrationen (> 100 µg/ml Lipid), hydrophile Oberflächen, zweiwertige Kationen und negativ geladene Lipide zu einer schnelleren Vesikelspreitung (Reimhult et al. (2006)). Zusätzlich haben auch die Gesamtionenstärke, die Art der zweiwertigen Kationen, der Phasenzustand und der Ladungszustand der Lipide einen solchen Einfluss auf den Prozess, daß die Variation in einem der erwähnten Parameter dazu führen kann, dass die Spreitung nicht, oder nicht vollständig erfolgt. Zwar ist die Vesikelspreitung bis heute Gegenstand zahlreicher Untersuchungen mit Rasterkraftmikroskopie (AFM), Oberflächenplasmonresonanzspektroskopie (SPR) und Schwingquarzmikrowaagen (QCM-D, quartz crystal microbalance dissipation) (Richter et al. (2003); Reimhult et al. (2004); Morigaki und Tawa (2006)), es finden sich jedoch bislang keine ATR-FTIR-Studien zur Vesikelspreitung.

54

3 Ergebnisse und Diskussion

3.1.2 Durchführung Für die in dieser Arbeit durchgeführen Vesikelspreitungen wurden wie in 2.2.6.2 beschrieben SUVs aus Palmitoyloleylphosphatidylcholin (POPC) und hydophilisierte GermaniumIREs verwendet (2.2.6.1). Während der Spreitung wurden in Abständen von 20 s bis 1 min Infrarotspektren aufgenommen um den Prozess der SSLB-Bildung anhand der Kinetiken der Lipidbanden zu verfolgen. Als membranbildendes Lipid wurde POPC verwendet, da seine Phasenumwandlungsstemperatur mit -3 °C weit unter Raumtemperatur liegt. Dies stellt sicher, dass sich der SSLB immer in der flüssig-ungeordneten Phase (ld, liquid disordered) befindet, die am ehesten die Fluidität der Plasmamembran nachbildet. Auf die Nachbildung der lateralen Segregation durch Rafts, die experimentell durch Mischung von Lipiden verschiedener Phasenumwandlungsstemperaturen zu erreichen ist, wurde in dieser Arbeit verzichtet. Grund hierfür ist, dass die ATR-FTIR Methode nicht mit lateraler Auflösung misst, und ein solches Experiment daher einen weiteren Versuchsparameter hinzufügen würde, dessen Einfluss nicht zu detektieren wäre. In einem weiteren Experiment ging es darum, die Geschlossenheit des Bilayers zu prüfen. Dazu wurde ein SSLB per Vesikelspreitung hergestellt, anschliessend mit Puffer C gespült und nach Aufnahme des Referenzspektrums dem zirkulierenden Durchflusssystem 0,8 µM BSA (Bovine Serum Albumin) zugesetzt. Danach wurden für 30 min im Abstand von 60 s Spektren aufgenommen. Diese Prozedur wurde für das zuvor bilayerbeschichtete IRE genauso wie für ein unbeschichtetes IRE durchgeführt. Um zu gewährleisten, dass die freie Germaniumoberfläche in den Lücken des SSLB im gleichen Zustand ist wie der unbeschichtete Kristall, wurde dieser für 120 min (die Dauer einer Vesikelspreitung) mit Puffer A gespült. Die Planarität der erzeugten SSLBs wurde durch dichroitische Messungen untersucht. Hierzu wurden Vesikelspreitungen durchgeführt, bei denen linearpolarsierte Spektren aufgenommen wurden (2.3.4). Während der gesamten Dauer der Vesikelspreitung wurden im Abstand von jeweils 20 s ein nichtpolarisiertes, ein parallel polarisiertes und ein vertikal polarisiertes Spektrum gemessen. Zur Umschaltung der einzelnen Polarisationrichtungen wurde ein selbstentwickelter Aufbau aus dem Messprogramm heraus angesteuert (2.4). Zum Vergleich wurde zusätzlich eine Vesikelspreitung mit 100 mM NaCl im Anlagerungspuffer (Puffer B) durchgeführt, bei der aufgrund der hohen Ionenstärke die Spreitung nicht stattfinden sollte (Seantier und Kasemo (2009)).

55

3 Ergebnisse und Diskussion

3.1.3 Vesikelspreitung 3.1.3.1 Ergebnisse

Abbildung 3.1: Spektrum eines POPC SSLBs. Positive Banden sind Lipidabsorptionsbanden, negative Absorptionsbanden werden durch die Verdrängung von Wasser durch das adsorbierte Lipid hervorgerufen.

Das Differenzspektrum des angelagerten POPC-SSLBs (Abb. 3.1) weisst zwei Bereiche positiver Banden von 3000 cm−1 bis 2800 cm−1 und von 1750 cm−1 bis ca. 1000 cm−1 auf (Abb. 3.1). Die größten Absorptionsbanden bei 2924 cm−1 und 2853 cm−1 werden von der asymmetrischen (νas (CH2 )) und der symmetrischen CH2 -Streckschwingung (νs (CH2 )) des Lipids hervorgerufen. Diese Banden liegen in der Gel-Phase bei 2916 cm−1 und 2850 cm−1 und in der ld-Phase bei 2924 cm−1 und 2853 cm−1 , was bedeutet, dass sich der präparierte Bilayer in der ld-Phase befindet. Im Bereich kleinerer Wellenzahlen absorbieren die CO-Streckschwingung der Ester-Carbonyl-Gruppe (1737 cm−1 ), die CH2 Biegeschwingung (1467 cm−1 ) und die symmetrische und antisymmetrische PhosphatStreckschwingung (1230 cm−1 und 1087 cm−1 ). Desweiteren sind im Vesikelspreitungsspektrum zwei große negative Wasserabsorptionsbanden bei 3356 cm−1 und 1640 cm−1 zu erkennen. Grund für diese negativen Banden ist, dass das Referenzspektrum in wässiger Lösung gemessen wurde (PufferA), und dass durch das adsorbierende Lipid eine Schicht von Wassermolekülen verdrängt wird. Da diese Wassermoleküle im Vergleich zum

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3 Ergebnisse und Diskussion

Referenzspektrum im Messvolumen fehlen ergibt sich ein negative Wasserbande. Zur Charakterisierung der Versikelspreitung und des generierten bilayers wurden in dieser Arbeit ausschliesslich die ν(CH)- und die ν(CO)-Bande des Lipids und die ν(OH)-Wasserbande bei 3360 cm−1 betrachtet.

Abbildung 3.2: Verschiedene Vesikelspreitungen. Der Vergleich verschiedene Vesikelspreitungen zeigt, daß der Prozess aus vier Phasen besteht. Die Transportkinetik-bedingte Adsorption der Vesikel (A), das kooperative Platzen der adsorbierten Vesikel (B), die Anlagerung von Vesikeln an den SSLB (C) und das Waschen oder Herausspülen der Vesikelsuspension durch Puffer bzw. Abwaschen von lose gebundenen Vesikeln (D).

Nach Zugabe der Vesikellösung zum zirkulierenden Messpuffer wurde die Adsorption der Vesikel anhand der Extinktion der größten Lipidabsorptionsbande (νas (CH2 )) bei 2924 cm−1 zeitlich verfolgt (Abb. 3.2). Beim Vergleich der Kinetiken verschiedener Messreihen ist zu erkennen, dass der Prozess in vier Phasen verläuft. In Phase A steigt die Extinktion innerhalb von 5 min von 0 auf 0,017 - 0,022 an. In Phase B steigt die Extinktion kaum noch an bzw. ist in machen Experimenten nach 8 - 10 min um ca. 0,003 abgesunken, so dass ein Extinktionsmaximum, der sog. overshoot entsteht. In Phase C nimmt die Extinktion bei allen Messungen zu, wobei jedoch die Steigung des oftmals linearen Anstiegs mit 0,001 bis 0,005 pro 30 min stark unterschiedlich sein kann. Abschliessend wird in Phase D das System vom zirkulärem Modus in den Durchspülmodus geschaltet und die Vesikellösung durch Puffer aus der Messküvette verdrängt. Hierbei stagniert die Extinktion oder verringert sich leicht, um nach mindestens 120 min eine

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3 Ergebnisse und Diskussion

stabilen Wert von 0,025 - 0,017 zu erreichen.

3.1.3.2 Diskussion Im Folgenden werden die Ursachen für die in Abb. 3.1 gezeigten Phasen der Vesikelspreitung anhand von Literaturdaten erörtet. Phase A: Adsorption Starker Anstieg der Extinktion bedingt durch die Adsorption von Vesikeln. Ursache hierfür ist die elektrostatische Interaktion zwischen IRE Oberfläche und Vesikeln, die durch die Kopfgruppenladung der Lipide, den pH-Wert, die Hydrophilität der Germaniumoberfläche und der Konzentration von zweiwertigen Kationen moduliert wird (Richter et al. (2006); Reimhult et al. (2003); Seantier und Kasemo (2009)). Die Kinetik des Prozesses ist schneller als die Transportkinetik des Durchflusssystems, in dem der komplette Austausch der Küvettenvolumens ca. 3 min benötigt. Phase B: overshoot Kleiner Signalabfall bedingt durch das Zerplatzen der adsorbierten Vesikel. Da die Gesamtoberfläche der adsorbierten Vesikel größer ist als die Oberfläche der resultierenden Membran, müssen Teile der platzenden Vesikel wieder von der Oberfläche desorbieren. Damit ergibt sich ein Extinktionsmaximum, der sog. overshoot, der auch in anderen Messsystemen beobachtet wurde (Richter et al. (2006); Morigaki und Tawa (2006)). Es konnte gezeigt werden, dass dieser Prozess bei schwacher Interaktion zwischen Oberfläche und Vesikeln erst ab einer kritischen Vesikeldichte stattfindet und dass die Vesikel bei starker Interaktion einzeln platzen, sobald sie Kontakt zur Oberfläche haben (Abb. 3.3A, B, Richter et al. (2003)). Im letzteren Fall ist kein overshoot zu sehen. Beeinflusst wird diese Phase durch die elektrostatische Interaktion (s.o.) und zusätzlich durch die Vesikelgröße. Berechnungen von Efremov et al. (2004) zeigen, dass Vesikel, die aus weniger als ca. 1300 Lipiden bestehen (entsprechend ca. 70 nm Durchmesser bei 70 Å2 /Lipid) keine Lipid-Discs (adsorbierte deformierte Vesikel) bilden können, sondern die Adsorption zu sofortigem Spreiten der Vesikel führt. Phase C: Lipid an Lipid Adsorption Geringer oft linearer Anstieg der Extinktion, verursacht durch die Anlagerung von Vesikeln an den bestehenden SSLB oder die bereits adsorbierten Vesikel (Morigaki und Tawa (2006)). Der hieraus entstehende Extinktionszuwachs ist nicht linear zur adsorbierten Lipidmasse, da das evaneszente Feld exponentiell abfällt (37 % bei 386 nm) und die zusätzlich adsorbierten Lipid-

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3 Ergebnisse und Diskussion

Moleküle somit mit einem geringeren Faktor in das Spektrum eingehen. Hauptursache dieses Effektes ist vermutlich das Vorhandensein von großen Vesikeln mit Durchmessern von > 200 nm. Die Oberfläche solch großer Vesikel ist flach genug um eine maximal große Interaktionsfläche mit dem SSLB bereitzustellen, ohne das aus der Interaktion die Energie zur Verformung des Vesikels gezogen werden müsste (Efremov et al. (2004)). Phase D: Waschphase Geringer oder kein Signalabfall. In dieser Phase desorbieren lose an den Bilayer adsorbierte Vesikel und werden aus der Messküvette gespült. Der so herstellte bilayer ist länger als 12 h stabil, Änderungen des Puffers können jedoch zu weiterer Vesikeldesorption führen, bis sich die Extinktion der νs (CH2 )-Bande bei 0,017 - 0,02 stabilisiert.

Abbildung 3.3: Verschiedene Interaktionmodi von Vesikeln mit Oberflächen nach Richter et al. (2006). Vesikel können bei Interaktion mit einer Oberfläche sofort (A) oder erst ab einer kristischen Oberflächenkonzentration spreiten (B). Sie können adsorbieren ohne zu spreiten (C) oder gar nicht an die Oberfläche anbinden (D).

Es zeigte sich, dass der Verlauf der Vesikelspreitung trotz standardisierter Versuchsabläufe stark von zwei schwer zu kontrolliereden Parametern abhängt. Zum Einen ist dies die Vesikelgröße und Größenhomogenität, zum anderen ist es die Reinigung und Hydrophilisierung des Germanium-IREs. Um die Vesikelgrößenabhängigkeit zu untersuchen, wurden Experimente mit Vesikeln unterschiedlicher Durchmesser durchgeführt, die mit

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3 Ergebnisse und Diskussion

Hilfe eines Extruders hergestellt wurden (Durchgeführt am LS für Biophysik, Diplomarbeit Philipp Pinkerneil (2009)). Hierbei wurde klar, dass die Vesikelherstellung per Extruder zwar gut und reproduzierbar funktioniert, jedoch im Vergleich zur UltraschallMethode sehr viel aufwändiger ist (10 min Inkubationszeit vs. 45 min Handarbeit). Für die nachfolgenden Experimente, in denen es um die Adsorption von lipidiertem Ras an den SSLB geht, ist es besonders wichtig, dass der erzeugte Lipidbilayer geschlossen und planar ist.

3.1.4 Geschlossenheit des SSLB Proteine adsorbieren an vielen Oberflächen und verlieren dabei zumeist irreversibel ihre Struktur. Daher ist es bei der gezielten Immobilisierung von Proteinen besonders wichtig, die Oberfläche derart zu funktionalisieren, dass das Protein nicht denaturiert. Ausserdem sollte die Funktionalisierung möglichst lückenlos sein. Dies ist besonders wichtig, wenn der Anteil des in den Lücken denaturierten Proteins zum Messsignal beiträgt und/oder die Affinität des Proteins für die Lücken höher ist als für die spezifische Immobilisierung.

3.1.4.1 Ergebnisse

Abbildung 3.4: Bilayer-Lückentest durch Adsorption von BSA. Gezeigt sind die Extinktionskinetiken des AmidII Absorptionsmaximums von BSA. BSA adsorbiert an das Germanium-IRE, jedoch nicht an den POPC bilayer. Der SSLB verdeckt die IRE Oberfläche zu mindestens 98 %.

Die Inkubation des unbeschichteten Germanium-IREs mit BSA führt zu einem starken Extinktionsanstieg der Proteinbanden (nicht gezeigt). Die Kinetiken in Abb. 3.4 entsprechen dem zeitlichen Verlauf des Maximums der Protein AmidII Bande (Emax (AmidIIBSA ) bei 1548 cm−1 ), und damit der an das IRE adsorbierten BSA-Menge. Die Extinktion der BSA-Anbindung auf unbeschichtetem IRE steigt innerhalb der ersten 5 min auf 0,009

60

3 Ergebnisse und Diskussion

und in den weiteren 26 min der Messung annähernd linear auf 0,01 an. Demgegenüber nimmt die Exinktion bei Inkubation mit dem SSLB nur gering linear auf ca. 0,0002 zu.

3.1.4.2 Diskussion In dem mit BSA durchgeführten Lückentest des Bilayers (3.4) zeigte sich, dass das Protein stark an die Germanium Oberfläche des IREs adsorbiert und eine Extinktion von 0,01 erreicht wird. Die sehr geringe Anbindung von BSA an den SSLB mit einer Extinktion von 0,0002 lässt den Schluss zu, dass das Protein schwach bzw. gar nicht an POPC Bilayer anbindet. Dies zeigt, dass die mit dieser Methode hergestellten SSLBs zu mindestens 98 % geschlossen sind.

3.1.5 Planarität des SSLB Mit linearpolarsierten ATR-FTIR Messungen ist es möglich Informationen über die Ausrichtung von Übergangsdipolmomenten und damit auch über die Orientierung von adsorbierten Molekülen zu erhalten. Dies erfordert eine hohe Probenanisotropie und damit als Grundlage ein planares IRE und einen planaren Bilayer.

3.1.5.1 Ergebnisse

Abbildung 3.5: Lineardichroitische Spektren eines POPC-SSLB. Die Banden der App - und Avp Spektren weisen eine 1,2 - 1,5-fach unterschiedliche Extinktion auf.

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3 Ergebnisse und Diskussion

Bei Messung der Vesikelspreitung mit Polarisator zeigte sich, dass die erhaltenen Spektren (Abb. 3.5) die gleichen Bandenlagen aufweisen wie das POPC-Spektrum einer unpolarisierten Messung (Abb. 3.1). Die Extinktionen bei parallel polarisiert gemessenen Spektren sind jedoch höher als bei vertikal polarisiert gemessenen: Das dichroitische Verhältnis (Rexp = Epp /Evp ) der wichtigsten Absorptionsbanden liegt bei 1,4 für νas (CH2 ), 1,34 für νs (CH2 ), 1,2 für ν(CO) und 1,52 für ν(OH).

Abbildung 3.6: Ordungsparameterkinetik einer Vesikelspreitung mit und ohne 100mM NaCl. In der Messung mit NaCl liegen die Ordnungsparameter der CH und CO Gruppen des Lipids nahe bei Null. Dies bedeutet, die Lipide isotrop orientiert sind, sich also kein Bilayer gebildet hat. Zum Vergleich mit den in Abb. 3.2 gezeigten Vesikelspreitungen ist zusätzlich die unpolarisierte Extinktionskinetik der νas (CH2 )-Bande gezeigt.

Zur Auswertung der polarisiert gemessenen Kinetiken wurde zunächst für jedes Spektrum das Integrale der ν(CH) und ν(CO) Bande anhand der in Tab. 2.6 aufgelisteten Integrationsgrenzen berechnet. Mittels der Integrale wurden die Ordungsparameter der Alkanketten (SCH ) und der CO-Gruppen (SCO ) des POPC mit Gl. 2.16 und den Paramtern aus Tab. 2.6 wie in Abschnitt 2.3.4.3 beschrieben berechnet. Da die parallel und vertikel polarisierten Messungen mit 20 s Abstand aufgenommen wurden, sind die Integrale der App Spektren auf die Messzeitpunkte der Avp Spektren linear interpoliert worden. Abb. 3.6 zeigt die zeitliche Entwicklung von SCH und SCO während der Vesikelspreitung jeweils mit und ohne NaCl im Puffer. Zum Vergleich mit dem 4 Phasenmodell der Vesikelspreitung (3.1.3.2) ist zusätzlich die Extinktionskinetik der unpolarisiert ge-

62

3 Ergebnisse und Diskussion

messenen νas (CH2 )-Bande aufgetragen. Die Extinktion der νas (CH2 )-Bande weisst in 0 mM NaCl einen overshoot mit einem Maximum von 0,027 bei 5 min auf und verringert sich nach insgesamt 12 min bis auf 0,022. Demgegenüber weisst die Anbindung in 100 mM NaCl keinen overshoot auf, wobei die Extinktion nach 5 min bei 0,027 liegt und sich dann geringfüging auf ca. 0,029 bei 14 min erhöht. Alle Ordnungsparameter der CHund CO-Banden mit und ohne NaCl liegen in der ersten Phase der Spreitung (2 - 6 min) bei ca. 0 - 0,1. SCH und SCO bleiben unverändert bei 0 - 0,1 für die Kinetiken mit NaCl, wohingegen die Werte für SCO ohne NaCl parallel zur νas (CH2 )-Kinetik ohne NaCl auf -0,2 absinken und SCH ohne NaCl spiegelbildlich zur νas (CH2 )-Kinetik auf 0,3 ansteigt.

3.1.5.2 Diskussion Um die Planarität und molekulare Ordnung der SSLBs zu untersuchen, wurden die Vesikelspreitungsexperimente mit polarisierter ATR-FTIR durchgeführt. Anhand der Ordnungsparamterkinetiken der Alkankette (SCH ) und der CO-Gruppe ist zu erkennen, dass sich die molekulare Ordnung in den Experimenten ohne NaCl nach dem overshoot erhöht. Dieses ist im Experiment mit 100 mM NaCl nicht zu erkennen, denn hier bleiben SCH und SCO nahe bei 0. Diese Beobachtung lässt sich damit erklären, dass nur im Experiment ohne NaCl eine geordnete Struktur, also ein Bilayer entstanden ist, wohingegen bei Anwesenheit von NaCl nur die Adsorption von Vesikeln gemessen wurde (Für weitere Erklärung des Ordnungsparameters siehe 3.1.6). Anhand der Ordnungsparameterkinetik von Vesikelspreitungen (Abb. 3.6) kann somit zwischen der Ausbildung eines planaren, geordneten Bilayers und der Adsorption von intakten Vesikeln unterschieden werden. Dies zeigt, dass die polarisierte Messung eine zusätzliche unabhängige Messgröße einbringt, durch die geometrische Informationen über die Probe gewonnen werden können.

3.1.6 Quantitative Infomationen über die erzeugten SSLBs Zusätzlich zur Berechnung der Ordnungsparameter S erlaubt die dichroitische Messung die Ermittlung von Oberflächenkonzentrationen Γ (2.3.4.4). Um quantitative Aussagen über den SSLB im Hinblick auf seine Schichtdicke, die Fläche pro Lipid und die Lipidoberflächenkonzentration zu erhalten, wurden linearpolarisierte Messungen von 5 Vesikelspreitungen zusammen ausgewertet. Hierzu wurden jeweils die letzten drei Spektren jeder Messreihe analysiert.

63

3 Ergebnisse und Diskussion

Tabelle 3.1: Quantitative Informationen über die erzeugten SSLBs. Gezeigt sind Mittelwerte von 5 Vesikelspreitungen, die Grundlage für einige der gezeigten Messungen mit lipidiertem N-Ras bildeten. Ausgewertet wurden jeweils die letzten drei Spektren jeder Spreitung.

Gruppe ν(CH)

Parameter A Γ a

Fläche/Lipid SCH c ν(CO) ν(OH)

a b c d

e f

b

A SCO

e

vp

MW

SD

MW

SD

cm−1 pmol/cm2 ng/cm2 Å2

1,34 381 290 87 0,27

0,07 47 36 10 0,09

0,88 477 363 70

0,04 54 41 8

cm−1

0,312 -0,16

0,024 0,05

0,242

0,013

cm−1 nmol/cm2 nm

-15,3 -19,6 3,5 -0,07

1,6 4,7 0,9 0,14

-10,4 -22,0 4,0

0,6 2,3 0,4

d

A Γ d(H2 O-Film) SOH f

pp

Einheit

Mit M(POPC) = 760 g/mol Berechnet für einen Bilayer Mit β = 90 °, SCH gibt den Ordnungsparameter der Alkankette wieder Mit β = 0 °, SCO entspricht dem Ordnungsparameter des Übergangsdipolmoments der CO-Bindung Dicke des verdrängten H2 O-Films für V(H2 O) = 29,92 Å3 Mit β = 0 °

Die Werte für Γ wurden nach Gl. 2.19, mit den Parametern aus Tab. 2.6 berechnet. Hierzu wurde eine Fehlerrechnung nach der Monte Carlo Methode mit jeweills 105 Realisationen pro Parameter durchgeführt. Die integrierten Absorptionswerte (A) und die daraus berechneten Primärergebnisse Γ und S für die jeweilligen Banden sind in Tab. 3.1 aufgeführt. Die aus Γ abgeleiteten Grössen Fläche/Lipid und Schichtdicke des verdrängten Wasserfilmes wurden mit M(POPC) = 760 g/mol und einem molekularen Wasservolumen von 29,92 Å3 berechnet. POPC Oberflächenkonzentrationen Die in dieser Arbeit hergestellten SSLBs weisen eine POPC-Oberflächenkonzentrationen von 381 ± 47 bzw. 477 ± 54 pmol/cm2 für Γpp bzw. Γvp auf. Der Unterschied zwischen Γpp und Γvp ist darauf zurückzuführen, dass in der Berechnung von einer isotropen Probe ausgegangen wird, der Bilayer jedoch eine geordnete Struktur ist. Γpp und Γvp liegen nahe an der von Tatulian (2003) veröffentlichten Oberflächenkonzentration von 460 pmol/cm2 für einen mit Langmuir-Blodgett (LB) Technik auf einem Germanium-IRE erzeugten

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3 Ergebnisse und Diskussion POPC Monolayer (230 pmol/cm2 für den Monolayer). Auch Reiter et al. (2002) hat durch Vesikelspreitung von POPC SUVs auf einem per LB-Methode erzeugten DPPA Monolayer mit 202 pmol/cm2 (404 pmol/cm2 für einen Bilayer) ähnliche Werte erhalten. Bei Umrechnung der molaren in eine Massenoberflächenkonzentration ergeben sich für Γpp und Γvp Werte von 290 ± 36 und 363 ± 41 ng/cm2 . Auch diese Werte stimmen mit dem von Reimhult et al. (2006) mit SPR ermittelten Wert von 350 ng/cm2 für einen aus POPC-SUVs auf SiO2 erzeugten SSLB überein. Ein weiterer Parameter, der sich aus der Oberflächenkonzentration berechnen läßt ist die Fläche, die ein POPC Molekül in dem SSLB einnimmt. Diese Fläche liegt für die in dieser Arbeit erzeugten SSLBs bei 87 ± 10 Å2 /Lipid für pp und 70 ± 8 Å2 /Lipid für vp und ist annähernd so groß wie der Literaturwert für DOPC von 81 Å2 (Rand (1981)). Molekulare Ordnung Der Ordnungsparameter S gibt die molekulare Ordnung einer Struktur in Bezug auf eine bestimmte Raumrichtung wieder und nimmt Werte von 1 (perfekt ausgerichtet) bis -0,5 (90 ° zur Referenzrichtung) an. Ein Wert von 0 kann hierbei eine komplett isotrope Ausrichtung oder eine Ausrichtung im magischen Winkel von 54,7 ° bedeuten. Die erzeugten SSLBs weisen SCH Werte von 0,27 ± 0,09 für die Alkanketten auf, was zwischen den von Tatulian (2003) und Reiter et al. (2002) gefunden Werten von 0,05 und 0,46 liegt und annähernd den von Seelig und Seelig (1980) publizierten NMR-Ordnungsparamtern von 0,15 - 0,2 (Palmitoyl) und 0,1 (Oleyl) entspricht. Der SCH von 0,27 kann auch als eine mittlere Verkippung der Fettsäureketten von ca. 44 ° gegen die Membrannormale interpretiert werden. Damit lässt man allerdings ausser Acht, dass ein Bilayer in der Membranmitte sehr viel weniger geordnet ist als in der Nähe der Lipidkopfgruppen (Vogel et al. (2005)) und der SCH somit ein Mittelwert der einzelnen CH-Orientierungen darstellt . Der Ordnungsparameter der Carbonylfunktionen der Fettsäuren SCO ist -0,16 ± 0,05. Vielfach wurde angenommen, daß die CO-Ester-Gruppen von Phospholipiden im magischen Winkel ausgerichtet sind und damit als isotrope Gruppen angesehen werden können. Aufgrund dieser Annahme wurden oftmals die für die CO-Gruppe ermittelten Rexp Werte dem Risoexp des Experimentes gleichgesetzt. Mittels Festkörper-NMR wurde jedoch gezeigt, daß zwar das sn1 -Carbonyl nahe dem magischen Winkel orientiert ist, das sn2 -Carbonyl jedoch eher in Membranebene ausgerichtet ist (Braach-Maksvytis und Cornell (1988)). Desweiteren ergaben polarisierte ATR-FTIR Studien an Multilayer-Filmen von DPPC und DMPC in

65

3 Ergebnisse und Diskussion

der ld-Phase für beide CO-Gruppen Ordnungsparameter von -0,18 bis -0,26. Dieses Ergebnis spricht deutlich für eine CO-Ausrichtung in Membranebene und stimmt sehr gut mit dem SCO dieser Arbeit überein. Dies bedeutet, dass die CO-Gruppen in den erzeugten SSLBs einen Winkel von 62 ° mit der Membrannormalen bilden. Bilayer Schichtdicke Die mittlere Schichtdicke des SSLBs wurde anhand des verdrängten Wasservolumens berechnet und liegt bei 3,5 ± 0,9 nm für pp und 4,0 ± 0,4 nm für vp. Ein Vergleich mit den Bilayerdicken, die mit anderen Methoden ermittelt wurden wie z.B. 4 nm (SPR, Morigaki und Tawa (2006)), 4 nm (AFM, Richter et al. (2003)) oder 3,9 nm (MD Simulation, Leekumjorn und Sum (2007)) zeigt, dass es sich bei den SSLB Präparationen nicht um Mono- oder Multilayer, sondern um Bilayer handelt. Dies wurde auch durch AFM-Untersuchungen der Vesikelspreitung auf Germanium-IREs bestätigt (ca. 4 nm Schichtdicke, durchgeführt am LS für Biophysik, Diplomarbeit Laven Mavarani (2009)). Zusätzlich zeigt der für den Wasserfilm berechnete Ordnungsparamter SOH von -0,07 ± 0,14, dass die OH-Dipole der Wasserschicht wie erwartet isotrop ausgerichtet sind.

3.1.7 Fazit Zusammenfassend kann folgendes über den Zustand der in dieser Arbeit mit der Methode der Vesikelspreitung erzeugten SSLBs festgestellt werden: Die SSLBs: • befinden sich im flüssig ungeordneten Phasenzustand • sind zu mindestens 98 % geschlossen • sind von erwarteter molekularer Ordnung (SCH = 0,27, CO-Gruppe steht in 62 ° zur Membrannormalen) • weisen eine Fläche pro Lipid von 87 bzw. 70 Å2 auf • haben mit 4 nm eine typische Bilayerdicke und stehen somit als Grundlage für die Untersuchungen von membrangebundenem lipidiertem Ras Protein zur Verfügung.

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3 Ergebnisse und Diskussion

3.2 Anbindung von lipidiertem Ras an einen SSLB Nachdem die Herstellung eines SSLBs auf dem IRE als Grundlage für alle weiteren Experimente etabliert wurde (3.1), konnte die Anbindung des lipidierten Ras an den Bilayer erfolgen. Da das Protein in vivo über den Farnesyl-Rest zuerst an die Membran des Endoplasmatischen Retikulums anbindet und erst dort die Palmitoyl-Modifikation erhält, ist der Anbindungsprozess des lipidierten Ras an den POPC-Bilayer von artifizieller Natur. Die Beobachtung dieses Prozesses ist jedoch aus den folgenden Gründen von Bedeutung: Einerseits soll aus den Anbindungs- und Abwaschkinetiken die Stabilität der Immobilisierung ermittelt und Rückschlüsse über die Ursache der Immobilisierung gewonnen werden. Andererseits soll mit linearpolarisierten Messungen die bislang unbekannte molekulare Ausrichtung des immobilisierten Proteins im Bezug zum Bilayer ermittelt werden (1.5.3). Da nachfolgend der Einfluss der Membranverankerung auf die intrinsische Hydrolyse und die Interaktion mit Effektoren untersucht werden soll, muß zunächst eine grundlegende Charakterisierung des Anbindungsprozesses und des membrangebundenen Ras erfolgen.

3.2.1 Durchführung Zur Anbindung von lipidiertem Ras wurde zunächst eine festkörpergestützte Modellmembran durch Vesikelspreitung hergestellt (siehe 3.1 und 2.2.6.3), dann ein Pufferwechsel zum Puffer C durchgeführt und das Durchflusssystem auf zirkulierend eingestellt. Das Mess-System, bestehend aus ATR-Küvette, Schläuchen und Ventilen, hatte hierbei ein Volumen von 1,4 ml. Das Reservoir, in das die Probe gegeben wurde hatte zusätzlich ein Volumen von 0,4 ml, so dass sich ein Gesamtsystemvolumen von 1,8 ml ergab. Nachdem ein Referenzspektrum des SSLBs in Puffer C mit 400 Scans aufgenommen wurde, wurde das semisynthetische Ras (1.6) in 0,1 ml Puffer C hinzugegeben, so dass sich eine Endkonzentration im System von 5 µM ergab. Die Proteinlösung wurde für 10 - 24 h zirkulierend über die Oberfläche gepumpt, wobei in den ersten 30 min minütlich ein Spektrum mit 200 Scans, danach für die Dauer der gesamten Anbindung alle 5 min ein Spektrum mit 400 Scans aufgenommen wurde. Bei den polarisierten Messungen wurden während der Anbindung nacheinander unpolarisierte (Anp ), parallel polarisierte (App ) und vertikal polarisierte Spektren (Avp ) gemessen. Auch hierbei wurden für 30 min Spektren mit 200 Scans gemessen, wobei sich bei 43 s pro 200 Scans ein zeitlicher Abstand von 129 s zwischen den Spektren gleicher Polarisierung ergab. Danach wurde für die restliche Dauer der Anbindung im 5 min Abstand alle drei Spektren mit je 400 Scans gemessen. Nach-

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3 Ergebnisse und Diskussion

dem die AmidII-Bande eine Extinktion von ca. 0,008 - 0,012 erreicht hatte wurde das System in den Durchflussmodus geschaltet und mindestens 1 h mit Puffer C gespült. Danach stand das immobilisierte Protein für weitere Experimente zur Verfügung. Die Kontrolle auf spezifische Anbindung über den Lipidanker wurde im Rahmen der in 3.3 beschriebenen Experimente durchgeführt und fand daher in D2 O-Puffer statt. Für weitere Informationen zur Durchführung dieses Experiments siehe Abschnitt 3.3.1.

3.2.2 Ergebnisse 3.2.2.1 Spezifität, Assoziation und Dissoziation

Abbildung 3.7: Spektren der Anbindung von lipidiertem Ras an einen POPC-SSLB nach 30, 60, 120, 240 und 480 min. Die Spektren wurden gegen den SSLB als Referenz aufgenommen und besitzen daher spektrale Anteile von angebundenem Ras, verdrängtem Wasser und den Differenzsignalen des Lipidbilayers. Die mit X markierten Banden sind durch den Silikonspacer verursacht, und treten nur in machen Messungen auf.

Nach Zugabe des lipidierten Ras zum zirkulierenden Durchflusssystem kam es zur Anlagerung des Proteins an den Lipidbilayer. Die Spektren der Anlagerung (Abb. 3.7) besaßen im niederfrequenten Spektralbereich positive Proteinabsorptionsbanden bei 1651 (AmidI), 1548 (AmidII) und 1403 cm−1 (AmidIII). Im höherfrequenten Spektralbereich waren Banden bei 3286 (AmidA), 2966, 2936 und 2975 cm−1 (aliphatische Aminosäureseitenketten und Lipidanker) zu erkennen. Zusätzlich zu den positiven Proteinabsorptionsbanden waren negative Banden bei 3670 - 3100 cm−1 (OH-Streckschwingungsmoden), hervorgerufen durch die Verdrängung von Wasser, sowie Lipiddifferenzbanden bei 2924 (νas (CO)), 2854 (νs (CO)) und in geringem Maße auch bei 1740−1 (ν(CO)) zu erkennen.

68

3 Ergebnisse und Diskussion

Aus Referenzmessungen ist bekannt, dass es sich bei den Banden bei 1260, 1076, 1021 und zum Teil auch 2966 cm−1 um Absorptionsbanden des Silikonspacers handelt (Abb. 3.7). Dies ist in Abb. 3.7 auch daran zu erkennen, dass die durch den Spacer verursachten Banden im Gegensastz zu den Proteinbanden in den Spektren bei 30 und 60 min noch nicht vorhanden sind. Der Silikonspacer ist als Abdichtungsmaterial in direktem Kontakt mit dem IRE, und obwohl er in den Referenzmessungen genauso vorhanden ist, können geringe Temperaturdifferenzen des Durchflusssystems oder eine Lockerung der Küvettenverschraubung zu solchen Artefakten führen (2.4). Abbildung 3.8: Anbindung von lipidiertem Ras an einen SSLB. Aufgetragen ist die Kinetik der AmidI-Extinktion während der Anlagerung. Ras ohne Lipidanker (H-Ras1-166) zeigt keine Anbindung. Diese Messungen wurde im Rahmen der in Abschnitt 3.3 beschriebenen Experimente in D2 O-Puffer durchgeführt.

Um herauszufinden, ob die Anbindung des Proteins durch den Lipidanker hervorgerufen wurde, wurde zunächst eine Kontrolle mit Ras1-166 (G-Domäne, Ras ohne Lipidanker) durchgeführt. Bei gleichem Messprotokoll wie bei dem lipidierten Protein konnte nach Zugabe von Ras1-166 kein Anstieg des AmidI-Signals gemessen werden (Abb. 3.8). Dies zeigt, dass die G-Domäne alleine keine Affinität zur Membran besitzt und dass das lipidierte Ras somit über den Membrananker an den Bilayer gebunden hat. Diese Anbindungen wurden in Rahmen der in Abschnitt 3.3 beschriebenen Experimente gemessen, und fanden daher in D2 O-Puffer statt. Die Anbindung von lipidiertem Ras an den POPC-SSLB war ein langsamer Prozess, der in den meisten Messungen über mindestens 10 h verfolgt wurde. Zur Analyse der Proteinanlagerungskinetik wurde die AmidII-Bande (Abb. 3.7) gewählt, da sie im Gegensatz zur AmidI-Bande nicht von der δ(H2 O)-Bande bei 1640 cm−1 überlagert ist. Die AmidIIBande wurde im Bereich von 1600 - 1485 cm−1 integriert und das Integral gegen die Zeit aufgetragen (Abb. 3.9A, B). Im gesamten Zeitraum der Anbindung stieg die Fläche der AmidII-Bande je nach Experiment auf 0,3 - 0,5 cm−1 , entsprechend einer maximalen

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3 Ergebnisse und Diskussion Extinktion der AmidII-Bande von ca. 0,008 - 0,013 bei 1550 cm−1 .

Abbildung 3.9: Anbindungen von lipidiertem Ras an einen POPC-SSLB. A: Kinetik einer Ras Anbindung (Messung F), gezeigt mit einer monoexponentiellen und einer biexponentiellen Anpassung. Das Inset zeigt den jeweiligen residualen Fehler der Anpassung. B: Kinetiken der AmidII-Bandenflächen verschiedener Anbindungen (Die Buchstaben entsprechen den einzelnen Messungen), wobei eine AmidIIBandenfläche von 0,5 einem AmidII-Bandenmaximum von ca. 0,014 entspricht. C: Die Kinetiken wurden mono- und biexponentiell angepasst und die Amplituden gegen die zugehörigen Zeitkonstanten der Anpassung aufgetragen. Gezeigt sind die Werte zusammen mit der jeweiligen Standardabweichung der Anpassung. Anbindung M wurde nur monoexponentiell angepasst, da eine Anpassung mit zwei Exponentialfunktionen zu keiner Verringerung des Fehlers führte.

Die Anbindungskinetiken konnten mit ausreichender Genauigkeit monoexponentiell angepasst werden, wobei die Zeitkonstanten der Anlagerung zwischen 250 und 430 min lagen (Abb. 3.9C) und keine lineare Abhängigkeit zwischen den Amplituden und Zeitkonstanten zu erkennen war. Eine biexponentielle Anpassung der Kinetiken zeigte jedoch, dass jede Anbindung aus zwei Prozessen bestand (Abb. 3.9A), einem schnellen Prozess mit einer Zeitkonstante von ca. 45 min, und einem langsamen Prozess mit einer Zeitkonstante von 330 - 500 min. Der schnellere Prozess wies eine geringere Amplitude von ca.

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3 Ergebnisse und Diskussion

0,05 auf und kann durch die langsame Durchmischungskinetik innerhalb des zirkulierenden Durchflusssystems erklärt werden. Für den zweiten Prozess zeigte sich eine ungefähr lineare Abhängigkeit der Amplitude von der Zeitkonstante des Prozesses. Daraus kann geschlossen werden, dass die adsorbierende Oberfläche in den Experimenten unterschiedlich groß ist. Bei Anlagerung G und D (Abb. 3.9C) war der erzeugte SSLB demnach mit adsorbierten Vesikeln versetzt, die zu einer Vergrößerung der Gesamtfläche des Bilayers führten. Die zweiten Zeitkonstanten der Anbindungen E, F und N repräsentieren somit mit Werten von 330 - 420 min die reale Anbindungskinetik des lipidierten Proteins an den SSLB.

Abbildung 3.10: Stabilität der Ras-Membran-Interaktion. Aufgetragen ist die Kinetik der AmidIIBandenfläche, integriert von 1600 - 1485 cm−1 , während der Proteinanlagerung und des Waschvorgangs. Das Inset zeigt einen vergrößerten Ausschnitt der Dissoziationskinetik und deren lineare Anpassung. Eine AmidII-Bandenfläche von 0,5 entspricht einem AmidII-Bandenextinktionsmaximum von ca. 0,014.

Um zu prüfen, wie stabil das Protein am Bilayer gebunden ist, wurde die Oberfläche bei einem Experiment nach einer 750 minütigen Anbindung für 660 min mit Puffer C im Durchfluss gespült. Die resultierende Dissoziationskinetik (Abb. 3.10) konnte jedoch nicht sinnvoll exponentiell angepasst werden. Eine lineare Anpassung ergab, dass die Hälfte des Proteins nach 161 h bzw. 6,7 Tagen von der Oberfläche dissoziiert wäre.

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3 Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 3.11: Polarisierte Spektren der Ras Anbindung an einen SSLB. Gezeigt sind Mittelwerte der letzten zehn Spektren der Assoziation von vier unterschiedlichen Anbindungsexperimenten. Das dichroitische Differenzspektrum D∗ wurde mit D∗ = App − Riso × Avp berechnet und ist bei isotroper Proteinausrichtung eine Nulllinie. Zur Berechnung von D∗ wurde ein konstanter Riso von 1,72 bzw. ein wellenzahlabhängiger Riso (ν) verwendet (siehe 2.3.4.2).

3.2.2.2 Proteinorientierung In weiteren Experimenten wurde die Orientierung des Proteins in Bezug zur Membran untersucht. Hierzu wurden Anbindungsexperimente wie zuvor beschrieben durchgeführt, jedoch während der Anbindung polarisierte Infrarotspektren aufgenommen. In Abb. 3.11 sind die Mittelwertsspektren der jeweils letzten zehn Spektren (je 400 Scans) der Anbindungen von vier unabhängigen Experimenten gezeigt. Die AmidI-Bande hat ein Doppelmaximum bei 1652 und 1640 cm−1 , wobei die Extinktion bei App bei 1652 und bei App bei 1548 cm−1 grösser ist. Die AmidII-Bande hat ihr Maximum bei 1548 cm−1 und eine Schulter bei 1518 cm−1 , die durch Tyrosinseitenkettenabsorption hervorgerufen wird. Eine negative Absorptionsbande, die nicht in allen Spektren zu finden ist, ist die νs (CO)Bande bei 1737 cm−1 , die durch Verdrängung von lose angelagertem Lipid in der Anfangsphase der Ras-Anbindung verursacht wird. Die parallel polarisiert gemessenen Spektren App besitzen eine ca. 1,7-fach höhere Extinktion als die vertikal polarisiert gemessenen

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3 Ergebnisse und Diskussion

Tabelle 3.2: Infrarotabsorption von α-Helices. Literaturwerte und experimentell ermittelte Orientierung. Aus den Extinktionen der Spektren in pp und vp bei 1661 cm−1 (AmidI) und 1545 cm−1 (AmidII) wurde der Ordnungsparamter S nach Gl. 2.16 und daraus der mittlere Winkel der Helices nach Gl. 2.17 berechnet.

AmidI E1 cm−1 a

Position / relative Intensität αb E bei ν / cm−1 E S θc a b

c

a

AmidII A

1662 - 1651 1656 - 1645 794 700 38 ° 1661 (1,8 ± 0,2)×10−3 0,19 ± 0,02 36 ± 2 °

E1 1551 310

A 1520 80 73 °

1545 (0,9 ± 0,2)×10−3 -0,05 ± 0,02 49 ± 2 °

nach Goormaghtigh et al. (1994c). Winkel zwischen Übergangsdipolmoment und α-Helixachse nach Marsh et al. (2000). mittlerer Winkel aller α-Helices, skaliert um die Anzahl ihrer Residuen relativ zur Membrannormalen.

Spektren Avp (Abb. 3.11). Bei isotrop ausgerichteten Molekülen und einem wellenzahlunabhängigen Brechungsindex des Mediums (n3 ) ist der Faktor zwischen App und Avp bei allen Wellenzahlen gleich und entspricht dem isotropen dichroitischen Verhältnis Riso . Das um Riso skalierte Differenzspektrum von App und Avp , das sog. dichroitische Differenzspektrum (D∗ = App − Riso × Avp ) ist daher für nicht ausgerichtete Proteine eine Nulllinie. Die dichroitischen Differenzspektren des membrangebundenen Ras weisen jedoch eine positive Differenzbande im AmidI-Bereich und eine negative Differenzbande im AmidIIBereich auf (Abb. 3.11). Die AmidI-Differenzbande liegt zwischen 1690 und 1630 cm−1 und hat ihr Maximum bei 1661 cm−1 , die AmidII-Differenzbande beginnt mit einer steilen Flanke bei 1560 cm−1 , hat ihr Minimum bei 1545 cm−1 und geht bis 1500 cm−1 wieder auf Null zurück. Hervorzuheben ist, dass die Differenzbanden nicht über den gesamten AmidI- und AmidII-Bereich verlaufen, sondern dass nur bestimmte Bandenbereiche von Null abweichen. Dies zeigt, dass nur einige Sekundärstrukturpopulationen, nämlich die in diesen Spektralbereichen absorbierenden α-Helices, eine Anisotropie aufweisen. Die Absorptionsbanden von α-Helices liegen zwischen 1662 und 1645 cm−1 im AmidI- und bei 1551 und 1520 cm−1 im AmidII-Bereich, wobei die Übergangsdipolmomente der AmidI Mode eher parallel zu Helixachse, die der AmidII eher senkrecht dazu liegt (Tab. 3.2). Dies bedeutet also, dass die α-Helices des membranverankerten Ras eher in z-Richtung,

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3 Ergebnisse und Diskussion

also vertikal zur Membranoberfläche ausgerichtet sind. Da die drei längsten der fünf Helices von Ras zusammen über 70 % der Helixresiduen stellen und parallel zueinander liegen, ergeben sich zwei Möglichkeiten der molekularen Orientierung des Proteins. Da der Lipidanker am C-Terminus des Proteins nahe der letzten Helix liegt, kann eine Orientierung, in welcher der C-Terminus auf der Membran abgewandten Seite liegt, ausgeschlossen werden (Abb. 3.13). Um die Orientierung der α-Helices quantitativ zu bestimmen, wurde der Ordnungsparamter für das Maximum der AmidI- und AmidII-Differenzbande berechnet. Zur Berechnung nach 2.3.4.3 wurde ein Winkel der Übergangsdipolmomente von 38 ° (AmidI) und 73 °(AmidII)(Tab. 3.2) und ein Ordnungsparamter der Membran von 0,9 angenommenen (Marsh et al. (2000)). Damit ergaben sich Ordnungsparameter von 0,19 ± 0,02 für die AmidI- und -0,05 ± 0,02 für die AmidII-Differenzbande. Der mittlere Winkel der α-Helices lag somit bei 36 ± 2 ° (AmidI) bzw. 49 ± 2 ° (AmidII), was eindeutig eine aufrechte Ausrichtung der α-Helices belegt. Theoretisch sollten die Werte der AmidI- und AmidII-Winkel gleich sein. Da jedoch das AmidII-Signal eine prozentuale Abweichung von 40 % besitzt und der AmidI-Wert nur 10 % Abweichung aufweisst wird im Folgenden nur der AmidI-Wert diskutiert. Da Riso für H2 O als Medium keine Konstante im AmidI- und AmidII-Bereich ist, sondern stark vom Brechungsindex von H2 O abhängt, wurden zusätzlich dichroitische Differenzspektren mit einem wellenzahlabhängigen Riso berechnet, der wiederum nach Gl. 2.13 berechnet wurde. Die verbesserte Auswertung ergab jedoch ausser geringen Intensitätsunterschieden der AmidI-Differenzbande keine Änderungen der Spektren (Abb. 3.11). Bisher wurde eine liegende Orientierung der G-Domäne angenommen, bei der die Ausrichtung des Proteins durch Interaktion mit der Membran stabilisiert würde (3.13). Bei der hier beobachteten aufrechten Orientierung wäre eine solche Stabilisierung nicht möglich. Daher wurde zunächst vermutet, dass es sich um eine oberflächenbelegungsabhängigen Effekt handelt, bei dem sich das Protein aufgrund sterischer Effekte zum Ende der Anlagerung aufrichtet (Berechung der Oberflächenbelegung siehe unten). Um diese Vermutung zu prüfen, wurden für die gesamte Anbindung dichroitischen Differenzspektren berechnet und die Differenzbande bei 1660 cm−1 für jedes Spektrum integriert. Das Integral wurde zusammen mit dem AmidII-Integral von orientierungskorrigierten Spektren (Aiso , zur Berechung siehe 2.3.4.1) gegen die Messzeit aufgetragen (Abb. 3.12). Die monoexponentielle Anpassung der beiden zuvor normierten Kinetiken ergab ähnliche Zeitkonstanten von 310 ± 7 min für die Aiso -Kinetik und 315 ± 7 min für die D∗ -Kinetik. Dies zeigt, dass die Proteinausrichtung unabhängig von der Oberflächenbeladung ist und somit durch die Interaktion mit der Membran hervorgerufen sein muss.

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3 Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 3.12: Kinetik der AmidII-Bandenfläche der Aiso -Spektren und der AmidI-Bandenfläche der D∗ -Spektren. Die Kinetiken wurde zur besseren Vergleichbarkeit normiert und monoexponentiell angepasst.

3.2.2.3 Oberflächenkonzentration und Belegungsdichte Aus den polarisiert gemessenen AmidII-Integralen App und Avp , die einem Anp -Integral von ca. 0,4 entsprechen, wurde mittels Gl. 2.19 und den in 2.6 aufgelisteten Parametern eine Ras-Oberflächenkonzentration von 12,1 ± 1,3 pmol/cm2 für App und 13,2 ± 1,4 pmol/cm2 für Avp berechnet. Die theoretisch maximale Oberflächenkonzentration von Ras variiert je nach Annahme der molekularen Fläche von 9 - 10 nm2 in einem Bereich von 16,6 - 18,5 pmol/cm2 . Damit ergibt sich für die Messungen, in denen von einem SSLB ohne zusätzliche Vesikelanlagerung ausgegangen werden kann und die AmidII-Banden Integrale von ca. 0,4 aufweisen (Abb. 3.9A, Messungen E, F und N), eine Oberflächenbelegungen von 65 - 80 %. Bei dieser Berechnung muß jedoch beachtet werden, daß sie aufgrund der Abschätzung der molekularen Fläche des Proteins und der mikroskopischen Rauheit des IREs (und damit auch des SSLBs) verhältnismäßig ungenau ist.

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3 Ergebnisse und Diskussion

3.2.3 Diskussion 3.2.3.1 Anbindung In diesem Abschnitt wurde die Anbindung des lipidiertem Ras an den POPC-Bilayer im Hinblick auf die Kinetik der Assoziation und Stabilität der Bindung, die Oberflächenkonzentration und die molekulare Ausrichtung des immobilisierten Proteins charakterisiert. Das Protein lagerte sich mit Zeitkonstanten von 330 - 420 min an den Bilayer an. Diese extrem langsame Anbindung kann dadurch erklärt werden, dass der Lipidanker vor dem Eintauchen in den hydrophoben Membranbereich zunächst die hydrophile Kopfgruppenschicht der Phospholipide durchdringen muss. Da diese thermodynamische Barriere je häufer übersprungen wird, desto mehr sich das Protein in Membrannähe aufhält, führt die geringe elektrostatische Anziehung zwischen G-Domäne und POPC-Bilayer (3.3) zusätzlich zu einer Verringerung der Anker-Insertionsereignisse. In einer IRRAS Studie mit dem auch im Rahmen dieser Arbeit verwendeten semisynthetischen N-Ras wurde die Adsorption an eine Lipidmonolayer untersucht (Meister et al. (2006)). Bei 20 mN/m Membrandruck insertierte das Protein bis zu einer Absorption von 0,0012, was bei Korrektur um die unterschiedliche Anzahl der Reflektionen mit 0,0144 ähnliche Werte wie in dieser Arbeit ergibt (IRRAS: 1 Reflektion; ATR(diese Arbeit): 12 aktive Reflektionen; ergibt 12-fach höheres Sinal). Da jedoch die von Meister et al. (2006) gemessenen Spektren ein zu geringes Signal/Rausch-Verhältnis aufwiesen, konnten die Autoren keine Aussagen über die Sekundärstruktur oder die Orientierung des membrangebundenen Proteins machen. Beim Vergleich der Kinetik einer Anbindung aus der frühen Phase der Arbeit (Abb. 3.8) mit den Anbindungen mit optimierter Vesikelspreitung (Abb. 3.9), fällt die bei den neueren Daten langsamere Kinetik auf. Dies könnte zum Einen durch eine grössere SSLB-Oberfläche bei den Sekundärstruktur-Experimenten (3.3), also ein SSLB mit aufgelagerten Vesikeln, oder die unterschiedliche Pufferzusammensetztung bedingt sein. In den Sekundärstruktur-Experimenten wurden D2 O-Puffer mit einem pD von 7,8 verwendet. Da Ras einen berechneten IEP von 5 besitzt hätte es in den D2 O-Puffern eine negativere Nettoladung, was die Anbindungskinetik beeinflusst haben könnte.

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3 Ergebnisse und Diskussion

3.2.3.2 Stabilität der Immobilisierung Die Dissoziation des immobilisierten Ras war so langsam, dass unter Annahme einer linearen Dissoziationskinetik innerhalb von 6,7 Tagen erst 50 % des Proteins vom Lipidbilayer abgelöst worden wäre. Verglichen mit der Halbwertszeit der Membranstabilität eines Lipopeptids mit Farnesyl- und Palmitoylanker von 3,4 Tagen (Shahinian und Silvius (1995)) ist der hier gefundene Wert annähernd zweifach höher, liegt jedoch in der gleichen Größenordnung. Die ennorm hohe Stabilität der Bindung ermöglichte es in nachfolgenden Experimenten erstmals, das gebundene Ras differenzspektroskopisch zu untersuchen, ohne dass das Ablösen des Proteins die Differenzspektren beeinflusste.

3.2.3.3 Orientierung Aus lineardichroitischen Messungen der Anbindung konnte die Orientierung der G-Domäne im Bezug zur Membran bestimmt werden. Als Mass für die Orientierung wurde der mittlere Winkel zwischen allen α-Helices des Ras-Proteins, jeweils skaliert mit der Anzahl ihrer Residuen, und der Membrannormalen bestimmt (Abb. 3.13B). Der mittlere Winkel lag bei 36 °, wobei allerdings beachtet werden muß, dass das Protein zusätzlich zu den drei parallel angeordneten Helices zwei senkrecht dazu liegende Helices besitzt. Der tatsächliche Winkel muss also kleiner sein als 36 °. Für die Orientierung der G-Domäne ergeben sich für Winkel ≤ 36 ° zwei mögliche Orientierungen: So könnte der C-Terminus entweder auf der membranabgewandten oder der membranzugewandten Seite der G-Domäne liegen. Da zwischen der ersten C-terminalen Lipidverankerung (Palmitoyl an C181) und dem C-Terminus der G-Domäne (R169) jedoch nur 14 zusätzliche Aminosäuren liegen, kann der C-Terminus aus sterischen Gründen nur auf der membranzugewandten Seite liegen. Eine solche stehende Ausrichtung steht im Widerspruch zur bisherigen Annahme einer liegenden Orientierung des Proteins (Abb. 3.13A). Die liegende Orientierung war das Resultat von Molekulardynamik- (MD) Simulationen und Modellingstudien, die in der Theoriegruppe des LS für Biophysik durchgeführt wurden (Persönliche Mitteilung Till Rudack) und entspricht der für H-Ras postulierten GTP-Orientierung (Gorfe et al. (2007a); Abankwa et al. (2008)). Beim Vergleich der beiden Orientierungen fällt auf, dass die liegende Orientierung mehr Membraninteraktionsfläche aufweist als die stehende Orientierung, in der das Protein wie ein umgekehrter Kegel auf der Membran steht. Zudem hätten bei einer stehenden Orientierung sowohl die α-Helix 4 (H4) als auch der loop zwischen β-Strang 2 und 3 (L2,3) keinen direkten Membrankontakt. Für die Residuen D47 und E49 in L2,3 sowie für R128 und

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3 Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 3.13: Unterschiedliche Ausrichtungen der G-Domäne von Ras im Bezug zur Membran. A: Die bislang favorisierte Orientierung von membrangebundenem N-RasGDP (liegende Ausrichtung) als Resultat von Molekulardynamik- Simulationen und Modellingstudien, die am LS für Biophysik durchgeführt wurden. Diese Orientierung entspricht dem Zustand von H-RasGTP nach Gorfe et al. (2007b). B: Orientierung mit senkrecht zur Membran ausgerichteten α-Helices (36 ° zur Membrannormalen für den Mittelwert aller Helices) und zur Membran ausgerichtetem C-Terminus (stehende Ausrichtung). Diese Orientierung geht aus den dichroitischen Messungen dieser Arbeit hervor. Auffällig ist die im Vergleich zur liegenden Orientierung (A) kleinere Membraninteraktionsfläche. C: Mögliche Dimerkonformation in der Aufsicht auf die Membran. Die von Gorfe et al. (2007a) und Abankwa et al. (2008) als für die Membraninteraktion bedeutsam eingestuften Residuen D47 und E49 im Loop zwischen β-Strang 2 und 3 (L2,3) und R128 und R135 in der α-Helix 4 (H4) sind als blaue Kugeln dargestellt. Die bedeutsamen Residuen liegen in diesem Modell direkt gegenüber und könnten somit für die Dimer-Stabilisierung über Salz-Brücken verantwortlich sein. D: Mögliche Dimerkonformation in der Seitenansicht. Für diese Abbildung wurde die Ras-GDP-Struktur 4Q21 verwendet und die Membranoberfläche durch weisse Kugeln dargestellt.

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3 Ergebnisse und Diskussion

R135 in H4 wurde jedoch eine Interaktion mit der Membran postuliert (Gorfe et al. (2007a); Abankwa et al. (2008)). Die Bedeutung dieser und der weiter C-terminal liegenden Residuen R169 und K170 (C-Term-Residuen) wurde durch Mutationsstudien in PC12-Zelldifferenzierungsassays, durchflusszytometrischen FRET-Messungen und quantitativem Immunoblotting ermittelt (Gorfe et al. (2007a); Abankwa et al. (2008)). In diesen Experimenten konnte gezeigt werden, dass eine Alanin-Mutation der H4-Residuen zu weniger, und der C-Term-Residuen zu mehr Wachstum und Differenzierung führt. Allerdings konnte in diesen in vivo Studien lediglich der Einfluss auf den Signaloutput der Regulationskaskade und auf die Lokalisation in verschiedenen Membrandomänen untersucht werden. Um ein Modell der molekularen Wirkung der fraglichen Residuen zu erhalten, haben die Autoren eine in MD-Simulationen gefundene GTP-GDP-abhängige Orientierung vor dem Hintergrund der in vivo-Daten interpretiert. In ihrem Modell, das sie als „novel switch“-Modell bezeichnen, ist das GDP-gebundene Ras mit den α-Helices eher aufrecht ausgerichtet und L2,3 hat zusammen mit den C-Term-Residuen Membrankontakt. Im GTP-Zustand liegen die α-Helices eher parallel zur Membran und L2,3 hat zusammen mit H4 Membrankontakt. Die in vivo nachgewiesene gegensätzliche Wirkung der C-Term-Residuen (deaktivierend) und der H4-Residuen (aktivierend) wurde daher durch eine Orientierungsänderung erklärt. Die Aussagekraft der dem Modell zugrundenliegenden Simulationen kann jedoch angezweifelt werden (u.a. fehlende Statistik, persönliche Mitteilung, Till Rudack und Henrick te Heesen). Da bislang keine biophysikalischen Untersuchungen zur Orientierung von membrangebundenem Ras existierten, kann lediglich die Bedeutung der diskutierten Residuen nicht aber ihre Funktion als gesichert gelten.

3.2.3.4 Dimerisiert Ras an der Membran? Betrachtet man nun die gesicherte Bedeutung der L2,3 und H4-Residuen zusammen mit der in dieser Arbeit gefundenen aufrechten Orientierung, kommt man zu dem Schluss, dass die L2,3 und H4-Residuen Kontaktstellen eines möglichen Ras-Dimers sein könnten. Bei einem wie in Abb. 3.13C und D gezeigten Dimer würden die kritischen Residuen von zwei Ras-Proteinen miteinander interagieren und nicht jeweils mit der Membran. Dies könnte zu einer Stabilisierung der kegeligen Ausrichtung eines Monomers führen, und die fehlende Membrannähe der L2,3 und H4-Residuen erklären. Es sind einige Beispiele für homodimerisierende GTPasen bekannt, wobei die Dimerisierung oft zu einer Beschleunigung der GTP-Hydrolyse führt. So führt z.B. die Kaliumionen-

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3 Ergebnisse und Diskussion

abhängige Dimerisierung des an der t-RNA Prozessierung beteiligten Proteins MnmE zu einer 2000-fachen Beschleunigung seiner GTPase Reaktion (Scrima und Wittinghofer (2006)). Auch bei den GTPasen GBP1, HypB und Septin-2 führt die Dimerisierung zu einer schnelleren Hydrolyse (Gasper et al. (2006); Ghosh et al. (2006)). Alle genannten Proteine dimerisieren bzw. interagieren innerhalb der Switch-Regionen miteinander. Im Gegensatz dazu liegt die Switchregion bei dem in dieser Arbeit postulierten membranabhängigen Ras-Dimer abseits der Dimerisierungsfläche, so dass hier keine Beschleunigung der GTPase Aktivität zu erwarten ist. Tatsächlich konnte in den Experimenten zur intrinsischen Hydrolyse des membrangebundenen Ras (3.5) kein signifikanter Unterschied zur Hydrolysekinetik in Lösung festgestellt werden. Hinweise auf eine membranabhängige Homodimerisierung von Ras erhielt man bereits im Jahr 2000 in einer Studie, in der die Aktivität der Raf-1 Kinase in Abhängigkeit verschiedener Ras-Zustände untersucht wurde (Inouye et al. (2000)). Hierbei stellte man fest, dass zur Aktivierung von Raf-1 zusätzlich zu RasGTP auch Liposomen vorhanden sein müssen. Da die Autoren in crosslinking Experimenten Ras-Dimere an den Liposomen gefunden haben, und sich Raf-1 durch artifiziell dimerisiertes Ras-GST auch in Lösung aktivieren liess, gingen sie von einer membranabhängige Homodimerisierung von Ras aus. In elektronenmikroskopischen Studien von Plasmamembran-Sheets wurden Anhäufungen von Ras-Molekülen gefunden, die sog. Nanocluster, die aus 6–8 Ras-Molekülen bestehen. Die Ursache dieses Clusterings sind noch weitgehend unbekannt, so dass es möglich wäre, das es sich bei den Nanoclustern um mehrere Dimere handelt (Omerovic und Prior (2009)). In vivo könnte eine transiente Dimerisierung von Ras zu einer verstärkten Interaktion mit Proteinen führen, die zwei Ras-Moleküle binden, wie z.B. dem Austauschfaktor SOS (Son Of Sevenless), der über eine katalytische und eine allosterische Bindestelle verfügt.

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3 Ergebnisse und Diskussion

3.3 Sekundärstruktur von membrangebundenem lipidiertem Ras Nachdem Ras spezifisch über den Lipidanker am SSLB immobilisiert werden konnte (3.2), wurde zunächst untersucht, ob die Membrananbindung strukturelle Änderungen des Ras-Proteins hervorruft. Anhaltspunkte für eine strukturelle Änderung waren durch eine NMR-Studie gegeben, in der farnesyliertes H-Ras bei Inkubation mit Vesikeln eine veränderte Flexibilität des zentralen β-Sheets aufwies (Thapar et al. (2004)). Ausserdem wurde mit Fern-UV-Ciculardichoismus-Spektroskopie eine geringe Strukturänderung bei Anbindung von Ras an Liposomen beobachtet (Thapar et al. (2004)). Die Struktur des für die Membranbindung verantwortlichen C-Terminus (As. 172 - 188) der auch die bislang noch nicht verstandene unterschiedliche in vivo-Funktion der Ras-Isoformen hervorruft ist noch weitgehend unbekannt. Zur Untersuchung des Membraneinflusses auf die Struktur wurde eine Sekundärstrukturanalyse der AmidI-Bande von membrangebundenem lipidiertem Ras durchgeführt. Zur Reduzierung der Freiheitsgrade der Sekundärstrukturanalyse wurde die Methode in einer bereits beschriebenen Prozedur (Ollesch et al. (2007)) mit der AmidI-Bande des löslichen Proteins anhand dessen bekannter 3D-Struktur kalibriert. Anschließend wurde der ermittelte Kalibrationsparametersatz in der Bandenzerlegung der AmidI-Bande des membrangebundenen Proteins verwendet. Die Ergebnisse dieses Abschnitts wurden in Güldenhaupt et al. (2008) bereits vorab veröffentlicht.

3.3.1 Durchführung 3.3.1.1 SSLB-Präparation und Proteinanlagerung Die ATR-Messungen dieses Abschnittes wurden am Infrarotspektrometer IFS66 durchgeführt, die verwendeten Messparameter finden sich in Tab. 2.5. Der SSLB wurde wie in Abschnitt 3.1 beschrieben mittels Vesikelspreitung von POPC-SUVs auf einem hydrophilisierten Germanium IRE präpariert und während der gesamten Messung minütlich ein Spektrum mit 256 Scans aufgenommen. Nach Ausbildung des Bilayers wurde die ATRKüvette mit 10 ml deuteriertem Puffer C (pD = 7,8) gespült. Um den Austausch von H2 O

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3 Ergebnisse und Diskussion

zu D2 O mit möglichst wenig D2 O-Puffer durchzuführen, wurden drei Verdünnungsschritte durchgeführt. In jedem Schritt wurde zuerst 2 ml im Durchfluss, dann 1 ml zirkulierend durch die Küvette gepumpt bis sich das Gleichgewicht zwischen H2 O, HDO und D2 O im gesamten Systemvolumen eingestellt hatte. Dies wurde anhand der Absorptionsbanden der Biegeschwingungen von H2 O (δ(H2 O), 1640 cm−1 ), HDO (δ(HDO), 1450 cm−1 ) und D2 O (δ(D2 O), 1200 cm−1 ) verfolgt. Nach der dritten Verdünnung sank der Anteil der δ(H2 O)-Bande unter die Nachweisgrenze und die Extinktion der HDO-Bande auf unter 5×10−4 gemessen gegen den vorherigen Verdünnungszustand. Damit wurde der Austausch als ausreichend angesehen und der SSLB 40 - 60 min mit D2 O-Puffer inkubiert, bevor das Referenzspektrum für die Proteinanbindung gemessen wurde. Danach wurde das semisynthetische Ras (HDFar-MIC-N-Ras1-181, 1.6) dem Durchflusssystem aus einer 40,8 mg/ml (= b 1,94 mM) H2 O Lösung bis auf eine Endkonzentration von 2,0 µM zugegeben. Die hierbei eingebrachten Protonen wurden bei einem Systemvolumen von 2 ml ca. 1000-fach verdünnt und führten zu geringer Bildung von HDO. Für die gesamte Dauer der Proteinanlagerung wurde jede Minute ein Spektrum mit 256 Scans gemessen und nach Erreichen der Sättigung der Proteinanlagerung, frühestens jedoch nach 10 h die Oberfläche mit frischem D2 O-Puffer gespült. Von diesem Zustand wurden nachfolgend die Spektren für die Sekundärstrukturanalyse gemessen. Bei allen Experimenten mit D2 O-Puffern wurden die Reservoirs des Durchflusssystems luftdicht abgeschlossen (Parafilm) um Kontamination mit H2 O-Dampf zu vermeiden.

3.3.1.2 Messung von Ras in Lösung Zur Messung von Ras in Lösung wurde H-Ras1-166 wie in Abschnitt 2.2.3 beschrieben mittels Ultrafiltrationssäulen in deuterierten Puffer C (pD = 7,8) überführt und bei 4 °C für 10 - 14 h inkubiert. Von dem somit größtenteils deuterierten Protein wurde ein Transmissions-FTIR-Spektrum aufgenommen. Hierbei wurde die Aquaspec-Zelle verwendet und die Messung wie in Abschnitt 2.5 beschrieben durchgeführt. Ras1-166 wurde in einer Menge von 1,8 mg in 100µl Volumen in den HD-Austausch eingesetzt.

3.3.2 Sekundärstrukturanalyse Die Spektren von membrangebundenem Ras und Ras1-166 in Lösung wurden wie in Abschnitt 2.6.2 beschrieben für die Bandenzerlegung vorbereitet. Danach wurde zunächst

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3 Ergebnisse und Diskussion

die AmidI’-Bande des Ras in Lösung in einem iterativen Verfahren (siehe 2.6.3) so angepasst, dass sowohl die Abweichung zur 3D-Struktur als auch die SD der Anpassung gering waren. Der durch diese Zerlegung erhaltene Parametersatz wurde zur Bandenzerlegung der AmidI-Bande des membrangebundenen lipidierten Ras verwendet. Diese Zerlegung entsprach daher einer Intensitätsanpassung der Komponentenbanden, was den Vorteil einer direkten Vergleichbarkeit der Sekundärstrukturen von membrangebundenem Ras und Ras in Lösung mit sich brachte.

3.3.3 Ergebnisse Abbildung 3.14: Seitenkettenkorrektur der Absorptionsspektren von Ras. Ein berechnetes Seitenkettenspektrum wurde anhand der Tyrosin-Bande auf das gemessene Spektrum skaliert und anschliessend subtrahiert. Exemplarisch ist dies für das Spektrum der Transmissionsmessung von Ras1-166 gezeigt.

Abb. 3.14 zeigt den Amid-Bereich des FTIR-Spektrums von Ras1-166 exemplarisch für beide Proteine. Die AmidI’-Bande hat ihr Maximum ca. bei 1640 cm−1 , die AmidIIBande ist durch den HD-Austausch größtenteils zu kleineren Wellenzahlen verschoben, wobei die entsprechende AmidII’-Bande bei 1450 cm−1 und damit außerhalb des dargestellen Bereichs liegt. Da einige Absorptionsbanden von Aminosäureseitenketten im AmidI-Bereich liegen, muß die AmidI-Bande vor der Bandenzerlegung um die Seitenkettenabsorptionen korrigiert werden. Diese Korrektur wurde wie in Abschnitt 2.6.2 beschrieben durchgeführt und ist in Abb. 3.14 exemplarisch für das Spektrum von Ras1-166 gezeigt. Um die Positionen der Komponentenbanden zu finden, wurden die zweite Ableitung und Fourier-Selbstentfaltung (FSD) berechnet. Hierzu wurden die seitenkettenkettenund basislinienkorrierten und auf eins normierten Spektren verwendet und wie in Abschnitt 2.6.3 beschrieben vorgegangen. Für Ras1-166 zeigten sich im Spektrum der zweiten Ableitung sieben lokale Minima, die bei 1691,5; 1671,5; 1659,0; 1637,5; 1617,5 und

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3 Ergebnisse und Diskussion 1611,5 cm−1 lagen. In dem mit FSD berechneten Spektrum waren an allen Positionen der lokalen Minima (außer 1617,5 cm−1 ) lokale Maxima zu erkennen. Diese Positionen dienten als Anhaltspunkte für die Bandenzerlegung. Abbildung 3.15: Zweite Ableitung und FSD der AmidI’-Bande von Ras. Gezeigt sind die seitenketten- und basislinienkorrigierte und auf eine Fläche von eins normierte AmidI’-Bande von Ras1-166 (schwarz), ihre zweite Ableitung (blau) und ihre Fourier-Selbstentfaltung (FSD, rot, skaliert um 0,4). Anhand der Maxima der FSD und der Minima der zweiten Ableitung können die Positionen der Komponentenbanden ermittelt werden, die als Startpositionen für die Bandenzerlegung dienen.

Die Bandenzerlegung wurde mit den seitenkettenkorrigierten und geglätteten Spektren wie in Abschnitt 2.6.3 beschrieben durchgeführt, wobei zunächst nur die AmidI’-Bande von Ras1-166 zerlegt wurde. Hierbei wurde die Zerlegung auf die Sekundärstrukturanteile der 3D-Struktur von Ras kalibriert, wobei zur Kalibration eine NMR-Struktur des GDPZustands von Ras (PDB-ID: 1CRP) verwendet wurde. Zur Kalibration wurde statt einer Röntgenstruktur eine NMR-Struktur verwendet, da die NMR-Struktur ebenso wie die FTIR-Spektren in Lösung gemessen wurden. Desweiteren besteht die Struktur 1CRP aus 20 Strukturmodellen, für die jeweils die Sekundärstrukturanteile einzeln berechnet wurden und deren Standardabweichungen die Variabilität der Struktur wiedergeben (Tab. 3.3). Bei der Kalibrierung der Bandenzerlegung wurde zunächst die AmidI’-Bande des Ras1-166 angepasst und für jedes Ergebnis die Standardabweichung (SD) der Anpassung und RMSD-Werte zwischen den Sekundärstrukturanteilen der Zerlegung und denen der 3D-Struktur berechnet (Gl. 2.23). Durch Variation der Anzahl und Startposition der Komponentenbanden wurde eine Lösung der Zerlegung gesucht, die sowohl die Daten gut beschreibt (niedrige SD) als auch eine geringe Abweichung zur 3D-Struktur aufweist (niedrige RMSD). Um eine Überanpassung der Daten (overfit) zu vermeiden, sollte die Anzahl der Komponentenbanden möglichst gering sein. Das Ergebnis dieses Optimie-

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3 Ergebnisse und Diskussion

rungsprozesses war ein Parametersatz von fünf Komponentenbanden, mit dem die Bandenzerlegung eine SD von 6,25×10−6 und eine RMSD zwischen IR- und NMR-Daten von 1,3 % ergab (Tab. 3.3). Die Komponentenbanden wurden anhand ihrer Bandenlagen im Vergleich mit Literaturwerten den verschiedenen Sekundärstukturen zugeordnet (Goormaghtigh et al. (1994a)). Die Bandenlagen waren 1666,6 cm−1 (Turn), 1652,1 cm−1 (αHelix), 1649,4 cm−1 (α-Helix), 1637,4 cm−1 (random coil) und 1631,6 cm−1 (β-Sheet) und sind in Abb. 3.16 zu sehen. Der Kalibrationsparametersatz bestand neben den Bandenpositionen aus den Bandenbreiten und der Bandenform, dem Gauss/Lorentz-Verhältnis. Diese Parameter wurden genau wie auch die Bandenpositionen bei der Anpassung der AmidI’-Bande des membrangebundenen Proteins nicht verändert, so dass die Anpassung nur über Variation die Bandenintensitäten erfolgte. Abbildung 3.16: Bandenzerlegung der AmidI’-Banden von membrangebundem Ras und Ras in Lösung. Gezeigt sind die seitenketten- und basislinienkorrigierten und auf eine Fläche von eins normierten AmidI’-Banden von membrangebundenem Ras und Ras1-166 in Lösung zusammen mit dem Komponentenbanden der Zerlegung.

Die AmidI’-Bande des Ras1-166 in Lösung und des membrangebundenen Ras sind sich sehr ähnlich (Abb. 3.16), weisen aber geringe Unterschiede im α-Helix- (1650 cm−1 ) und β-Sheet-Bereich (1630 - 1620 cm−1 ) auf. Die Zerlegung der beiden AmidI’-Banden ist in Abb. 3.16 dargestellt und die Ergebnisse sind in Tab. 3.3 zusammengefasst. Zur Fehlerabschätzung der Methode wurden die Sekundärstrukturwerte der 3D-Strukturen miteinander verglichen (Tab. 3.3). Hierbei zeigte sich eine Variabilität von fast 3 %-Punkten innerhalb der Random Coil-Werte der NMR Struktur und ein Unterschied von 1,3 - 6,1 %-Punkten zwischen den Turn bzw. Random Coil Strukturen der NMR und der Röntgenstruktur. Weiterhin lag der Unterschied zwischen der NMR-Struktur

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3 Ergebnisse und Diskussion

und der Bandenzerlegung von Ras1-166 zwischen 0,6 und 1,8 %-Punkten (Tab. 3.3). Daher wurde der Fehler der Methode auf 3 %-Punkte geschätzt. Dieser Fehler bezieht sich jedoch auf die Bestimmung der Absolutwerte der Sekundärstrukturen und nicht auf die relativen Änderungen zwischen den AmidI’-Banden, die mit grösserer Genauigkeit bestimmt werden können. Ras1-166 in Lösung und das membrangebundene Ras besitzen eine unterschiedliche Residuenanzahl (166 und 188). Daher wurden die Prozentwerte der Bandenzerlegung in die Aminosäureanzahl pro Sekundärstruktur umgerechnet (siehe Tab. 3.3). Geht man von einer strukturell unveränderten G-Domäne aus, entspricht die Differenz der Aminosäureanzahl pro Sekundärstruktur der Sekundärstruktur des Membranankers. Aus der Bandenzerlegung geht hervor, dass das membrangebundene Protein zusätzliche 12 As. in β-Sheet-Struktur, 1 As. in Random Coil-Struktur, 6 As. in α-Helix-Struktur und 3 As. in Turn-Struktur besitzt. Demnach liegt der Anker hauptsächlich in β-Sheet- und α-HelixStruktur vor.

3.3.4 Diskussion Die Messungen zeigen, dass die AmidI’-Banden des löslichen und membrangebundenen Proteins sehr ähnlich sind und nur graduelle Unterschiede aufweisen. Das lässt vermuten, dass die Struktur der G-Domäne bei Membrananlagerung unverändert bleibt. Wenn man davon ausgeht, dass die G-Domäne gar keine strukturellen Änderungen durchmacht, können die gemessenen Unterschiede als die Struktur des Ankers aufgefasst werden. Demnach besteht der Anker aus sechs α-Helixresiduen , 12 β-Sheetresiduen und einer kleinen Anzahl von Random Coil- und Turn-Residuen (Tab. 3.3). Der α-Helixanteil stimmt mit NMR-Untersuchungen überein, in denen eine Verlängerung der C-terminalen α-Helix 5 bis zu As. 172 gemessen wurde (Thapar et al. (2004); Reuther et al. (2006a)). Die geringe Anzahl von Random Coil-Residuen ist für diese als unstrukturiert angenommene Sequenz zunächst überraschend. Da der Anker jedoch allein aufgrund der Membrannähe Kontakte zu Lipidkopfgruppen ausbilden wird, ist eine andere Dynamik der Struktur als bei unstrukturierten Peptiden in Lösung zu erwarten. Der hohe β-Sheetanteil von 12 Residuen deckt sich mit NMR-Untersuchungen der Lipidankers, in eine vorwiegend hufeisenförmige Struktur des Ankers gefunden wurde, die als β-Sheet-ähnlich, aber sehr flexibel eingestuft wurde (Reuther et al. (2006a), persönliche Mitteilung, Daniel Huster, Universität Leipzig). Es kann jedoch nicht vollständig ausgeschlossen werden, dass es durch Ausbildung von H-Brücken zwischen den Peptidgruppen des Ankers und

86

3 Ergebnisse und Diskussion

Tabelle 3.3: Sekundärstruktur von membrangebundenem Ras. Die Sekundärstrukturzusammensetzung einer Röntgen- und einer NMR-Struktur von H-Ras1-166 sind im Vergleich zu den Ergebnissen der Bandenzerlegungen von H-Ras in Lösung und membrangebundenem Ras gezeigt. Durch die Kalibration der Zerlegung von löslichem Ras auf die Werte der NMR-Struktur wurde ein Kalibrationsparametersatz generiert, der in der Auswertung der mit membrangebundenem Ras gemessene Spektren verwendet wurde. Durch Umrechnung der Prozentwerte in Aminosäuren (As.) und Subtraktion des löslichen vom membrangebundenen Ras ergibt sich bei Annahme einer strukturell unveränderten G-Domäne die Sekundärstruktur des Ankerpeptides (167-188).

x-raya β-sheets random coils α-Helices turns SD β-sheets random coils α-Helices turns a b c d

e

25,9 13,3 37,3 23,5

43 22 62 39

NMRb 22,3 19,4 35,5 22,8

37 32 59 38

± ± ± ±

± ± ± ±

Lösungc

1,9 2,6 1,1 2,5

3 4 2 4

Membrand

Sekundärstrukturanteil / % 21,0 ± 3 25,1 ± 3 20,0 ± 3 18,1 ± 3 34,5 ± 3 24,6 ± 3 24,6 ± 3 33,3 ± 3 6,25×10−6 1,45×10−5

Sekundärstrukturanteil / As. 35 ± 5 47 ± 6 33 ± 5 34 ± 6 57 ± 5 63 ± 6 41 ± 5 44 ± 6

Ankere 56 4 25 15

12 1 6 3

Röntgenstruktur PDB-ID: 4Q21; Ras1-166 (Struktur wurde auf 166 Residuen gekürzt). NMR-Struktur PDB-ID: 1CRP; Ras1-166, Mittelwert von 20 Modellen. FTIR-Spektrum, Bandenzerlegung der AmidI’-Bande von Ras1-166, Mittelwert von vier Messungen. ATR-FTIR-Spektrum, Bandenzerlegung der AmidI’-Bande von membrangebundenem Ras1-188, Mittelwert von drei Messungen. Theoretische Sekundärstrukturzusammensetzung der Ankerregion 167-188 As., entspricht der Differenz (Membran - Lösung).

den Kopfgruppen der Membranlipide zu Verschiebungen der AmidI’-Moden kommt, die nicht durch die Sekundärstruktur bedingt sind. In Abb. 3.17 ist ein Modell der Membranverankerung von lipidiertem Ras zusammen mit den für den Anker berechneten Strukturanteilen gezeigt. Die Messungen in diesem Abschnitt wurden zusätzlich auch mit linearpolarisierter IRStrahlung durchgeführt, die Auswertung ergab jedoch nur geringe Unterschiede in den Sekundärstrukturen (< 1 %, Daten nicht gezeigt). Für die in Abschnitt 3.2 gefundene Orientierung des Proteins würden grössere Unterschiede erwartet, und auch der direkte Vergleich der Amid-Banden aus diesen Experimenten und den Experimenten aus Abschnitt 3.2 zeigte, dass das Protein hier nicht, bzw. gering ausgerichtet war. Da die Experimente in diesem Abschnitt in einer frühen Phase der Arbeit durchgeführt wurden, in der die Bilayerherstellung noch nicht optimiert war, könnte die geringere Ausrichtung

87

3 Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 3.17: Sekundärstruktur der Ankerregion von membrangebundenem Ras. Aus der Differenz der Sekundärstrukturen von Ras1-166 in Lösung und dem lipidierten membrangebundenen Ras wurde unter Annahme einer strukturell unveränderten G-Domäne die Sekundärstruktur der Ankerregion berechnet. Das gezeigte Strukturmodell des membrangebundenen Ras wurde von Till Rudack (LS für Biophysik, Ruhr-Universität Bochum) anhand von NMR-Daten (Thapar et al. (2004); Reuther et al. (2006a); Kraulis et al. (1994)) erstellt.

durch eine weniger planare Oberfläche hervorgerufen worden sein. Eine weniger planare Oberfläche wiederum kann durch die Adsorption einer zweiten Schicht von Vesikeln an den SSLB verursacht sein und würde zu einem geringeren dichroitischen Signal führen. Diese Hypothese wird in den Abschnitten 3.1 und 3.2 eingehend diskutiert, weshalb an dieser Stelle auf eine weitere Diskussion verzichtet wird. In einer IRRAS-Studie mit dem auch im Rahmen dieser Arbeit eingesetzten semisynthetischen N-Ras wurde bei der Untersuchung der Adsorption an einen Lipidmonolayer eine ähnliche AmidI’-Absorption gefunden. Da die erhaltenen Spektren jedoch ein zu geringes Signal/Rausch-Verhältnis aufwiesen (siehe hierzu auch die Diskussion von Kap. 4.3), konnten die Autoren keine Aussage über die Sekundärstruktur des membrangebundenen Ras treffen (Meister et al., 2006). Im nachfolgenden Abschnitt wird die Etablierung der differenzspektroskopischen Untersuchung des membrangebundenen Ras beschrieben und die damit erhaltenen Differenzspektren des Proteins mit denen von Ras in Lösung verglichen.

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3 Ergebnisse und Diskussion

3.4 Differenzspektroskopie an Ras Monolagen 3.4.1 Einleitung Nachdem es gelungen war, das lipidierte Ras spezifisch an einem festkörpergestützten Lipidbilayer zu immobilisieren (3.2), konnte anhand des Sekundärstrukturvergleiches mit Ras in Lösung gezeigt werden, dass die Membranimmobilisierung keine grossen strukturellen Änderungen hervorruft (3.3). Da jedoch auch geringe Strukturänderungen der Nukleotidbindetasche einen bedeutenden Einfluss auf die Funktion haben können, wurde die Aktivität des Proteins mit einem Ligandenbindungstest untersucht. Hierzu wurde BeF− 3 verwendet, das an Stelle das γ-Phosphats an RasGDP bindet, und so den Konformationswechsel des Proteins vom OFF- in den ON-Zustand bewirkt (Díaz et al. (1997); Kötting et al. (2007)). Der Vergleich des γ-Phosphats einer RasGTP Struktur (PDB− ID: 1QRA) mit dem BeF− 3 einer Struktur der GTPase Rap (RapGDP-BeF3 -RapGAP,

PDB-ID: 3BRW) zeigt, dass das γ-P-Atom und das Be-Atom einen ähnlichen Abstand zum β-P-Atom von 2,94 Å (Be) und 2,99 Å (γ-P) aufweisen. Desweiteren ist die Länge der Be-F Bindungen und die tetraedrische Koordination des Be-Atoms der Geometrie des γ-Phosphats sehr ähnlich. Diese strukturellen Ähnlichkeiten zeigen sich auch in einem annähernd gleichen FTIR-Differenzspektrum des Amid-Bereiches von GTP- und GDP+BeF− 3 -gebundenem Ras gegen den GDP-Zustand (Kötting et al. (2007)). Daher kann der RasGDP-BeF− 3 -Komplex als Grundzustandsanalogon angesehen werden. Berylliumfluoride bilden in wässriger Lösung ein Gleichgewicht zwischen den Komplexen [BeF4 ]2− , [BeF3 (H2 O)]− , [BeF2 (H2 O)2 ]0 , [BeF(H2 O)3 ]+ und [Be(H2 O)4 ]2+ aus (Mesmer und Baes (1969)). Aufgrund der stark polarisierenden Wirkung des Be-Atoms kommt es bei pH-Werten größer als 5,8 zur Hydrolyse der koordinierenden H2 O-Moleküle, so dass das Berylliumatom zum Teil von OH− komplexiert wird. Bei wässigen Lösungen mit alkalischem pH-Wert und einem geringen Konzentrationsverhältnis von Fluorid zu Beryllium kommt es daher zum Ausfall von unlöslichen Berylliumhydroxiden (Schmidt und Schmidbaur (1998); Schmidbaur (2001)). Da diese pH-Wert-Abhängigkeit bislang noch nicht quantitativ beschriebenen ist, ist es nicht möglich die Konzentration der mit Ras interagierenden Spezies BeF− 3 für jeden pH-Wert exakt zu berechnen. Trotz der Unwägbarkeiten bei der quantitativen Analyse eignet sich BeF− 3 gut um den OFF/ON-Zustandswechsel zu induzieren und so den Effekt der Membrananbindung anhand von Differenzspektren qualitativ zu untersuchen.

89

3 Ergebnisse und Diskussion

3.4.2 Durchführung Zunächst wurde ein SSLB wie in Abschnitt 3.1 beschrieben hergestellt, an dem nachfolgend das lipidierte Ras immobilisiert wurde (siehe 3.2). In den frühen, mit D2 O-Puffer durchgeführten Experimenten wurde Puffer C verwendet, wobei sich nach einigen Stunden ein weisslicher Niederschlag in den BeFx -Lösungen bildete. Daher wurde anschliessend zur Aufnahme von BeF− 3 -Differenzspektren ein im Vergleich zur Proteinanbindung niedrigerer pH-Wert verwendet, um den Ausfall von Berylliumhydroxiden zu vermeiden. Der Pufferwechsel von Puffer C (pH 7,4) nach Puffer D (pH 6,5) wurde durchgeführt, in dem die Küvette mindestens 30 min mit Puffer D gespült und der Pufferaustausch anhand von Differenzspektren verfolgt wurde. Hierzu wurden in drei Spektrenreihen von je 10 min jeweils ein Spektrum pro Minute (200 Scans) gemessen. Die jeweiligen Referenzspektren wurden von der mit Puffer C gespülten Oberfläche, der Oberfläche nach 10 min und nach 20 min Inkubation mit Puffer D aufgenommen. Tabelle 3.4: Messablauf des Berylliumfluorid-Titrationen

Step 1 2 3

ta

%Ab

%B

%C

%D

Flowc

%E

4 100 1 4 100-x x 1 Schleife → gehe zu Step2 mit anderem x

Tod

Scanse

tspec f

Refg

W W

1000 100

1 1

X

Reservoirdefinitionen A: Puffer D B: Puffer D; 4 mM BeF2 ; 16 mM NaF C: D: E: a b c d e f g

Dauer der Schrittes (min) %-Anteil der gepumpten Puffer der verschiedenen Reservoire Flussrate der Schlauchpumpe (ml/min) Ziel des Duchflussvolumens (W steht für waste, Abfall) Scans pro Spektrum Wartezeit zwischen zwei Spektren (s) X steht für die Messung eines Referenzspektrums

Die Titrationen mit BeF− 3 wurden mit einer Lösung von 4 mM BeF2 und 16 mM NaF in Puffer D durchgeführt, die verschiedenen Konzentrationen mit dem in Abschnitt 2.4 beschriebenen Aufbau gemischt und die Messungen nach dem in Tab. 3.4 beschriebenen Ablauf durchgeführt. Die Dissoziationskonstante KD des RasGDP-BeF− 3 -Komplexes wurde mit Gl. 3.1 zunächst anhand der Beryllium-Konzentration c(Be) berechnet und erst

90

3 Ergebnisse und Diskussion danach auf die c(BeF− 3 ) umgerechnet. Hierbei ist Emax die maximale zu erreichende Extinktion und E(c(Be)) die Extinktion bei der jeweiligen Beryllium-Konzentration.

E(c(Be)) =

c(Be) × Emax KD + c(Be)

(3.1)

3.4.3 Ergebnisse

Abbildung 3.18: Berylliumfluorid induziert den Wechsel vom OFF- in den ON-Zustand. Gezeigt ist der AmidI’-Bereich von 1850 - 1500 cm−1 . Die Oberfläche wurde abwechselnd 10 min mit Puffer und 12 min mit BeF− 3 -haltigem Puffer gespült (Es wurden D2 O-Puffer verwendet). Während des Experiments wurden Differenspektren der Ras-Monolage jeweils gegen den vorherigen Pufferzustand gemessen. Die Absorptionsbande von Thr35, einer charakteristischen Bande des ON-Zustands, liegt bei 1681 cm−1 .

Durch Inkubation des membrangebundenen Ras mit BeF− 3 -Puffer konnte der Zustandwechsel vom OFF- in den ON-Zustand induziert und differenzspektroskopisch nachgewiesen werden (Abb. 3.18). Die erhaltenen Differenzspektren weisen Banden auf, die charakteristisch für den Wechsel vom OFF- in den ON-Zustand sind, wie z.B. die positive durch Thr35 verursachte Bande bei 1681 cm−1 (Bandenlage in D2 O-Puffer, Kötting et al. (2007)). Der Zustandswechsel war vollständig reversibel, so dass bei mehrmaligem Wechsel zwischen Puffer mit und ohne BeF− 3 das gleiche Spektrum gemessen werden konnte.

91

3 Ergebnisse und Diskussion Die zeitliche Entwicklung der BeF− 3 -Differenzbanden entsprach hierbei der Transportkinetik des Durchflusssystems (kompletter Austausch in 90 s), weshalb die Kinetiken der Komplexbildung und des Komplexzerfalls zeitlich nicht aufgelöst werden konnten.

Abbildung 3.19: Berylliumfluoriddifferenzspektren mit Störungsanteilen. Die Inkubation mit verschiedenen BeF− 3 -Konzentrationen in H2 O-Puffer führt zu Änderungen der Biegeschwingungsbande von Wasser (δ(H2 O)). Der Phosphatbereich ist oft durch Artefaktbanden des Silikonspacers überlagert.

3.4.3.1 BeF− 3 -Differenzspektren Da Differenzspektren Informationen über die Aktivität und die Struktur von Proteinen beinhalten, sollte das BeF− 3 -Differenzspektrum des membrangebundenen Ras mit einem Spektrum von Ras in Lösung verglichen werden. Für diesen Vergleich musste zunächst ein Spektrum mit hoher Signalqualität in H2 O gemessen werden. Bei Messung der BeF− 3Differenzspektren in H2 O zeigte sich jedoch, dass die Zunahme der Ionenstärke bei Inkubation mit BeF− 3 zu einer Änderung der δ(H2 O)-Bande, und damit zu einer Verzerrung des AmidI-Bereichs führt (3.19). Desweiteren waren Artefaktbanden im Phosphatbereich (1300 - 1000 cm−1 ), die durch Absorptionen des Silikonspacers verursacht werden, und eine grosse positive, aus dem Messbereich herausragende Absorptionsbande unterhalb von 1000 cm−1 zu erkennen. Um Spektren mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis und ohne Artefaktbanden zu erhalten, wurde eine Titration der Oberfläche mit BeF− 3 -Lösungen verschiedener Konzentrationen

92

3 Ergebnisse und Diskussion (0,4 - 3,6 mM Be) durchgeführt. Da die KD des RasGDP-BeF− 3 -Komplexes im niedrigen millimolaren Bereich liegt (Díaz et al. (2000), eigene Messungen s.u.), sollte das Proteindifferenzsignal eine hyperbolische, mit KD titrierende, und das δ(H2 O)-Störungssignal eine lineare Abhängigkeit von der BeF− 3 -Konzentration aufweisen. Da die Artefaktbanden des Spacers keinen ursächlichen Zusammenhang mit der BeF− 3 -Konzentration haben, besitzen alle drei Signale eine unterschiedliche Abhängigkeit von der BeF− 3 -Konzentration. Daher konnte zur Trennung der Signale und Berechnung des puren BeF− 3 -Differenzspektrums die Methode der Multivariaten Kurvenanpassung mit alternierender least squares Optimierung (MCR-ALS) angewendet werden (2.7, 2.7).

Abbildung 3.20: Komponentenspektren der MCR-ALS-Auswertung einer BeF− 3 -Titration. Die Auswertung mit einer steigenden Anzahl von Startextinktionsprofilen zeigt die sukzessive Aufteiling der einzelnen Artefaktbanden auf die jeweiligen Komponentenspektren (1-5).

Für die MCR-ALS-Auswertung wurden 24 Spektren aus zwei verschiedenen Titrationsreihen verwendet, wobei die unterschiedlichen Konzentrationen in den Titrationsreihen randomisiert gemessen wurden. Die Spektren wurden einer Offsetkorrektur zwischen 1820

93

3 Ergebnisse und Diskussion - 1800 cm−1 unterzogen und der spektrale Bereich von 2000 - 900 cm−1 in die Anpassung eingesetzt. Als Startextinktionsprofil für das OFF/ON-Signal wurde die Differenzextinktion der positiven Bande bei 1158 cm−1 und der negativen Bande bei 1218 cm−1 verwendet. Für die zusätzlichen zwei bis fünf verwendeten Komponenten wurden normalverteilten Zufallszahlen (SD = 5×10−6 ) als Startkomponenten verwendet. Die Anpassung mit zwei Komponenten ergab zwei Ergebnisspektren, die beide Anteile des BeF− 3 -Differenzspektrums aufwiesen (Abb. 3.20A). Mit einer zusätzlichen Komponente ergab sich ein weiteres Spektrum, dass eine Bande zwischen 1700 und 1600 cm−1 aufweist, die Ähnlichkeiten mit einer δ(H2 O)-Bande besitzt (Abb. 3.20B). Das Differenzsignal ist jedoch auch hier auf die Spektren 1 und 2 verteilt. Bei Verwendung von vier Komponenten tritt zusätzlich ein Spektrum auf, dass für das Spacersignal typische Banden bei 1260 cm−1 und zwischen 1100 und 1000 cm−1 besitzt. Auch hier ist das OFF/ONSpektrum über die Komponentenspektren 1 und 2 verteilt (Abb. 3.20C). Durch Hinzunahme einer zusätzlichen Komponente trennt sich das OFF/ON-Signal vom Spektrum 2 ab, und die AmidII-Differenzbanden von Komponente 1 gewinnen an Intensität. Auch führt die Hinzunahme der fünften Komponente dazu, dass die δ(H2 O)-ähnliche Bande in Komponente 3 von einer asymmetrischen Form in eine symmetrische Form übergeht, die nun eher δ(H2 O)-Bande entspricht (Abb. 3.20D). Zwar sind auch bei fünf Komponenten noch OFF/ON-Spektrenanteile in anderen Spektren zu finden (4 und 5), diese Spektren haben jedoch eine geringere Intensität, was auch an ihrem höheren Rauschen zu erkennen ist. Zum Vergleich mit einem in Lösung gemessenen OFF/ON-Differenzspektrum wurde Spektrum 1 aus Abb. 3.20D einer linearen Basislinienkorrektur mit den Stützpunktregionen 2000 - 1980 cm−1 und 1820-1800 cm−1 unterzogen und auf den Maximalwert der Differenzextinktion der Banden bei 1158 cm−1 und 1137 cm−1 des Startextinktionsprofils skaliert. Das mit Transmissions FTIR-Spektroskopie gemessene BeF− 3 -Differenzspektrum von H-Ras1-166 in Lösung wurde von Angela Kallenbach zur Verfügung gestellt. Das Spektrum wurde mit 0,045 multipliziert um vergleichbare Extinktionen zum Spektrum des membrangebundenen Ras zu erhalten. Die Spektren weisen überwiegend identische Bandenpositionen auf, wie z.B. die für den Zustandswechsel von OFF nach ON charakteristische Thr35-Bande bei 1690 cm−1 . Auch die übrigen Banden des AmidI- und AmidIIBereichs weisen gleiche Bandenpositionen von 1676, 1664, 1642, 1630, 1581, 1565, 1547, 1530 und 1514 cm−1 auf. Auch im Phosphatbereich zwischen 1300 und 1000 cm−1 liegen die prominentesten positiven Banden bei 1254 und 1158 cm−1 und die negativen Banden bei 1218 und 1137 cm−1 in beiden Spektren an den gleichen Positionen. Neben

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3 Ergebnisse und Diskussion

− Abbildung 3.21: BeF− 3 -Differenzspektrum von membrangebundenem Ras. Zum Vergleich ist ein BeF3 Differenzspektrum von H-Ras1-166 in Lösung gezeigt (gemessen von Angela Kallenbach). Das H-Ras Spektrum wurde durch Multiplikation mit 0,045 auf eine ähnliche Differenzextinktion von E(1158 cm−1 ) - E(1137 cm−1 ) skaliert. Die Sterne kennzeichnen die grössten Unterschiede zwischen den Spektren.

geringen Intensitätsunterschieden im Amid-Bereich fehlen dem BeF− 3 -Differenzspektrum des membrangebundenen Ras zwei positive Banden bei 1410 und 1258 cm−1 und eine negative Bande bei 1714 cm−1 . Desweiteren weist das Spektrum des membrangebundenen Proteins eine grosse breite Bande unterhalb von 1030 cm−1 auf, die dem in Lösung gemessenen Spektrum fehlt. Diese Bande könnte durch die Infrarotabsorption von BeFSpezies verursacht sein, die im Referenzspektrum der ATR-Messung nicht, wohl aber bei der Transmissionsmessung vorhanden sind (Kötting et al. (2007), eigene Messungen, Daten nicht gezeigt). 3.4.3.2 BeF− 3 -Titrationen Aus den Extinktionen der Titrationskurven konnte nach Auftragung gegen die Berylliumkonzentration c(Be) anhand von Gl. 3.1 die Dissoziationskonstante KD des RasBeF− 3 -Komplexes und die maximale Differenzextinktion ∆Emax berechnet werden (Abb. 3.22, der KD ist um den Quotient c(Be)/c(BeF− 3 ) skaliert, s. u. ). Die KD -Werte im Be-

95

3 Ergebnisse und Diskussion

− Abbildung 3.22: KD -Titration des membrangebundenen Ras mit BeF− 3 . Mehrere BeF3 -Titrationen (1,2 und 3) wurden im Abstand von zwei Tagen an der selben Probe (c) durchgeführt.

zug zu c(Be) liegen bei ca. 1 mM, die Werte für ∆Emax variieren je nach Proteinmenge und Aktivität. Die in Abb. 3.22 gezeigten Titrationskurven sind an der selben Probe im Abstand von 0 h (c1), 44 h (c2) und 49 h (c3) aufgenommen worden. Durch eine solche Messung mehrerer Titrationskurven zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Ras-Membrananlagerung kann die Aktivität des Proteins während der über mehrere Tage verlaufenden Messreihe verfolgt werden. Als Aktivität kann die Grösse des maximalen BeF− 3 -Differenzsignals ∆Emax im Verhältnis zur Gesamtproteinmenge aufgefasst werden. Der Quotient der Differenzextinktion (∆Emax ), skaliert um die Anzahl der Aminosäuren (n), und der die Gesamtproteinmenge repräsentierende AmidII-Fläche (A(AmidII)) wird im folgenden als Aktivitätsquotient (QAktBeF x ) bezeichnet. QAktBeF x = (∆Emax × n)/A(AmidII)

(3.2)

QAktBeF x ist maximal bei komplett aktivem Protein und minimal bei inaktivem Protein. In Abb. 3.23 sind die Differenzsignale von mehreren Messungen unterschiedlicher Messreihen gegen die jeweilige AmidII-Bandenfläche aufgetragen. Bei einer Messreihe, bei der das Protein von der Oberfläche dissoziiert, und das weiterhin gebundene Protein aktiv bleibt, verändert sich der Quotient zwischen ∆Emax und der AmidII-Fläche kaum (a1: QAktBeF x = 0,34 cmAs; a3: QAktBeF x = 0,33 cmAs). Wird das Protein jedoch inaktiver und bleibt gebunden, verringert sich ∆Emax bei gleichbleibender AmidII-Fläche was zu

96

3 Ergebnisse und Diskussion

einem niedrigeren QAktBeF x führt (c1: QAktBeF x = 0,18 cmAs, c3: QAktBeF x = 0,1 cmAs). Interessanterweise sind die KD -Werte der Messreihe c davon kaum beeinflusst, was zeigt, dass das Protein nicht in halbaktiven Zwischenzuständen vorliegt, sondern entweder aktiv oder inaktiv ist.

Abbildung 3.23: Aktivitätstest durch BeF− 3 -Titration. Gezeigt sind die KD und ∆Emax -Werte von mehreren Titrationen (Zahlen) unterschiedlicher Messreihen (Buchstaben), aufgetragen gegen die AmidIIBande des immobilisierten Ras zum Titrationszeitpunkt. Der Quotient von ∆Emax und AmidII-Fläche repräsentiert die Proteinaktivität, der KD ist völlig unabhängig von der Oberflächenbeladung oder Aktivität.

Die BeF− 3 -Konzentration ist von der Beryllium- und Fluorkonzentration und vom pHWert der Lösung abhängig, wobei sich je nach Konzentrationsverhältnis und pH-Wert verschiedene BeFx (OH− )y -Spezies bilden. Für dieses dynamische Gleichgewicht wurde mit dem Programm Visual MINTEQ (Version 2.61, Gustafsson (2009)) berechnet, in welchen Konzentrationen die aktive Komponente BeF− 3 in den Experimenten vorlag. Bei Konzentrationen von 4 mM BeF2 und 16 mM NaF ergab sich ein Verhältnis von c(BeF− 3 ):c(Be) von 0,37. Das bedeutet, dass eine KD von 1 mM im Bezug auf c(Be) einer KD von 370 µM im Bezug auf c(BeF− 3 ) entspricht.

3.4.4 Diskussion In diesem Abschnitt wurde die Etablierung der Differenzspektroskopie an Ras-Monolagen beschrieben, die aufgrund der geringen immobilisierten Proteinmenge von ca. 100 pmol

97

3 Ergebnisse und Diskussion

erhebliche Anforderungen an die Stabilität von Probe und Messaufbaus stellt. Es wurde das γ-Phosphat-Analogon BeF− 3 verwendet, um den Einfluss der Membrananbindung von Ras auf den Zustandswechsel vom OFF- in den ON-Zustand zu untersuchen. Mit MCR-ALS konnte ein BeF− 3 -Differenzspektrum aus den Daten extrahiert werden. Die Differenzspektren von membrangebundenem Ras und Ras in Lösung waren nahezu identisch. Die Differenzbanden des Phosphatbereichs bei Anlagerung von BeF− 3 sind bislang noch nicht zugeordnet, da aber die α-Phosphatbande im GDP-Zustand bei 1230 cm−1 und im GTP-Zustand bei 1263 cm−1 liegt, kann angenommen werden, dass es sich bei der Bande bei 1245 cm−1 um eine blauverschobene α-GDP-Bande handelt (Abb. 3.21, Allin et al. (2001)). Im GDP Zustand liegt die νa (β-PO−2 3 )-Bande bei 1139 cm−1 und 1104 cm−1 und im GTP Zustand bei 1219 cm−1 (νa (β-PO− 2 )). Die Anla−2 gerung von BeF− 3 führt demnach zu einer zu einer Verstärkung der β-PO3 -Absorption

bei 1104 cm−1 und einer verminderten Absorption bei 1139 cm−1 . Desweiteren könnte die positve Bande bei 1157 cm−1 als eine Verschiebung der β-GDP Absorption zu dieser für γ-GTP charakteristischen Bandenpososition interpretiert werden. Die im Differenzspektrum des membrangebundenen Ras fehlenden Differenzbanden bei 1714 und 1410 cm−1 sind ebenfalls noch nicht zugeordnet. Anhand von Literaturwerten lässt sich jedoch vermuten, dass sie durch eine Deprotonierung von Aspartat- oder Glutamat-Carboxylgruppen hervorgerufen wurden (Barth (2000)). Die Deprotonierung könnte durch eine Änderung des pH-Wertes verursacht worden sein, die durch die Anbindung von BeF− 3 an das Ras verursacht wurde. Da in wässiger Lösung ein dynamisches Gleichgewicht zwischen den verschiedenen BeF-Spezies existiert und die nicht mit F abgesättigeten Bindungen des Be je ein H2 O oder OH− binden, führt die Bildung von Ras-BeF− 3 zur Einstellung eines neuen Gleichgewichts, und kann somit auch den pHWertes beeinflussen. Bei einem zu geringen Verhältnis von Fluor zu Beryllium (c(F) < − 10c(Be)) würde die BeF− 3 -Anbindung zu einer Freisetzung von H2 O bzw. OH führen.

Dies könnte das Probenvolumen basischer machen und so die Deprotonierung verursachen. Dieser Effekt kommt in den ATR-Spektren nicht zum Tragen, da das System im Durchfluss betrieben wird und die Proteinmenge sehr gering ist. Zusammenfassend konnten anhand der Differenzspektren keine signifikanten Unterschiede zwischen membrangebundenem Ras und Ras in Lösung erkannt werden. Die geringen Unterschiede im AmidI-Bereich könnten auf Änderungen der Proteinorientierung zurückzuführen sein. Dies könnten jedoch nur kleinere Änderungen sein, da durch eine vollständige Orientierungsänderung um 90 ° eine ca. 10-fach grössere Differenzbande

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3 Ergebnisse und Diskussion

zu erwarten wäre (vgl. 3.2). Eine weiterer Grund für die geringfügig unterschiedlichen Intensitäten könnte durch die MCR-ALS-Auswertung bedingt sein, da das OFF/ONSpektrum geringfügig über zwei Komponentenspektren verteilt war. Eine Verbesserung der Auswertung z.B. über die Vorgabe von bekannten Spektren als Startwerte der Optimierung könnte zu einer verbesserten Trennung der einzelnen Komponentenspektren und damit zu einem eindeutigeren OFF/ON-Spektrum führen. −1 und Die Kinetik der BeF− 3 -Anlagerung an Ras besitzt Ratenkonstanten von 0,5 - 2 s

konnte daher aufgrund der langsamen Transportkinetik des Durchflusssystems nicht untersucht werden (Kötting et al. (2007); Díaz et al. (1997), zur Transportkinetik siehe 3.6.5). Der hier ermittelte KD des RasGDP-BeF− 3 -Komplexes von 370 µM ist ca. 20-fach geringer als der für die Mutante RasY32W ermittelte Wert von 8,1 mM (Díaz et al. (1997)). Dies kann durch den weniger stabilen ON-Zustand dieser Mutante (Persönliche Mitteilung, Carsten Kötting, LS für Biophysik, Ruhr Universität Bochum), oder in geringem Maße durch Unterschiede in der Berechnung der effektiven BeF− 3 -Konzentration verursacht sein. Weiterhin konnten durch die wiederholte BeF− 3 -Titration innerhalb einer Messreihe Veränderungen des Anteils von aktivem zu gebundenem Protein als Verringerung des Aktivitätsquotienten QAktBeF x identifiziert werden. Zusätzlich konnte in Form des KD eine oberflächenbelegungsunabhängige Größe der Proteinaktivität ermittelt werden.

99

3 Ergebnisse und Diskussion

3.5 GTP Hydrolyse von membrangebundenem Ras 3.5.1 Einleitung Nachdem die Vesikelspreitung zur Generierung eines SSLB etabliert (3.1) und die Anbindung von lipidiertem Ras an den Bilayer charakterisiert wurde (3.2), konnten die Sekundärstruktur und die molekulare Orientierung des membrangebundenen Proteins ermittelt werden (3.3 und 3.2). Danach konnte durch Verwendung des γ-Phosphatanalogons BeF− 3 die differenzspektroskopische Untersuchung der Ras-Monolage etabliert, und so die Aktivität des Proteins nachgewiesen werden (3.4). Diese Techniken und die dadurch ermöglichten Ergebnisse bildeten die Grundlage für die Untersuchung der GTP-Hydrolyse von membrangebundenem Ras, die in diesem Abschnitt beschrieben wird. Die Einfluss der Membran auf die GTPase-Aktivität ist bislang noch nicht untersucht worden, in NMR-Experimenten wurden jedoch gezeigt, dass farnesyliertes vesikelgebundenes H-Ras eine erhöhte Flexibilität des zentralen β-Sheets, des p-Loops, des Switch1 und Switch2, den Helices 1, 3 und 5 und von Loop 2 und 4 aufweist (Thapar et al. (2004)). Diese membraninduzierten Änderungen der Flexibilität könnten einen großen Einfluss auf die Bindung und die intrinsische Hydrolyse von GTP haben. Um diesen Einfluss zu untersuchen, wurde die Kinetik und das Differenzspektrum der Hydrolyse von membrangebundenem Ras mit Ergebnissen von Ras in Lösung verglichen. Um die GTP Hydrolyse von membrangebundenem Ras zu untersuchen, muss das Protein in den GTP Zustand gebracht werden. Die etablierten Methoden zum Nukleotidaustausch konnten jedoch weder mit dem lipidierten Ras in Lösung, noch mit dem membrangebundenem Protein durchgeführt werden. Daher musste zunächst eine Methode entwickelt werden, die den Nukleotidaustausch in situ, am membrangebundenen Protein erlaubte.

3.5.2 Durchführung Zunächst wurde ein SSLB wie in 3.1 beschrieben hergestellt und das semisynthetische Ras wie in 3.2 beschrieben am Lipid-Bilayer immobilisiert. Anschließend wurde das Protein durch eine differenzspektroskopisch detektierte BeF− 3 -Titration wie in 3.4 beschrieben auf seine Aktivität hin getestet. Danach wurde versucht, mit dem immobilisierten Protein einen Nukleotidaustausch durchzuführen. Hierbei lag das Protein im

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3 Ergebnisse und Diskussion

GDP-Zustand vor und sollte in den GTP gebundenen Zustand überführt werden. Hierzu wurde die EDTA-Methode (Tucker et al. (1986); Lenzen et al. (1998)) als Startpunkt der Etablierung gewählt. Diese Methode beruht darauf, dass die Nukleotidaffinität des Ras durch einen EDTA-vermittelten Entzug des an der Nukleotidbindung beteiligten Mg2+ -Ions verringert wird. Allerdings musste beachtet werden, dass zweiwertige Kationen an der Stabilisierung des SSLB beteiligt sind, weshalb der Entzug von Mg2+ zur Zerstörung der Membran führen könnte. Außerdem ist nukleotidbefreites Ras nicht stabil, was zu einer schnellen Denaturierung des Proteins führen kann. Unter Beachtung dieser Einschränkungen wurden unterschiedliche Konzentrationen, Mischungsverhältnisse, Einwirkzeiten und Durchflussgeschwindigkeiten von EDTA, MgCl2 , GTP und GDP getestet. In Tab. 3.5 ist der Messablauf gezeigt, mit dem der Nukleotidaustausch und die nachfolgenden Hydrolysemessungen erfolgreich durchgeführt werden konnten. Tabelle 3.5: Ablauf des Nukleotidaustausches und der Hydrolysemessung.

Step 1 2 3 4 5 5 6 7

ta

%Ab

%B

b c d e f g

%D

%E

Flowc

4 100 1 5 50 50 1 5 100 1 4 100 1 x 50 50 1 6 50 50 1 10 100 1 Schleife → gehe zu Step1 mit x=(10,20,40)

Reservoirdefinitionen A: Puffer D ohne B: Puffer D ohne C: Puffer D ohne D: Puffer D ohne E: a

%C

Tod

Scanse

tspec f

Refg

W W W W W W W

1000 200 200 1000 200 200 200

1 16 16 1 16 16 16

X

X

GDP GDP; 4 mM BeF2 ; 16 mM NaF GDP und Mg2+ ; 20 mM EDTA GDP und Mg2+ ; 0,1 mM GTP

Dauer der Schrittes (min) %-Anteil der gepumpten Puffer der verschiedenen Reservoire Flussrate der Schlauchpumpe (ml/min) Ziel des Duchflussvolumens (W steht für waste, Abfall) Scans pro Spektrum Wartezeit zwischen zwei Spektren (s) X steht für die Messung eines Referenzspektrums

Für die Referenzmessung der Hydrolysekinetik von Ras in Lösung wurde ein N-Ras1-181 Konstrukt verwendet, das C-terminal einen Strep-Tag und nachfolgend einen His-Tag aufwies (N-Ras1-181StrepHis). Der Nukleotidaustausch von 3 mg Protein wurde in 200 µl

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3 Ergebnisse und Diskussion

Tabelle 3.6: Messablauf der Hydrolysemessung von N-Ras in Lösung.

Messdauer (min)

Scans pro Spektrum

Wartezeit zwischen Spektren (s)

30 60 120 2880

200 400 1000 2000

1 5 60 300

Volumen wie in Abschnitt 2.2.2 beschrieben durchgeführt und die Austauscheffizienz mit HPLC (2.2.4) ermittelt. Danach wurde das Protein entweder direkt in die FTIRMessung eingesetzt oder in flüssigem Stickstoff schockgeforen und bei -80 °C gelagert. Die FTIR-spektroskopische Hydrolysemessung erfolgte mit der Aquaspec-Zelle wie in Abschnitt 2.5 beschrieben. Hierzu wurden 40 µl des GTP-gebundenen Proteins mit einer Hamiltonspritze in die Aquaspec-Transmissionszelle injiziert und die Messung gestartet. Vor der Injektion wurde die Aquaspec-Zelle 10× mit 50 µl Puffer NB gespült, und kurz davor ein Hintergrundspektrum mit 2000 Scans aufgenommen. Die Messungen wurde bei 20 ° über 32 h nach dem in Tab. 3.6 gezeigten Messablauf durchgeführt. Als Vergleichskriterium von differenzspektroskopischen Messungen von Proteinen in verschiedenen Probenzuständen (z.B. Transmission vs. ATR) kann der Quotient aus der Extinktion einer Differenzbande und der Gesamtextinktion einer Bande der Probe gebildet werden (siehe 3.4.3.2). Beim Vergleich von zwei Proteinen mit unterschiedlicher Residuenanzahl, aber gleicher, das Differenzspektrum erzeugender, aktiver Domäne muss die AmidII-Bandenfläche pro Aminosäure zur Berechnung verwendet werden. Der Quotient (Aktivitätsquotient, QAktHyd ) ist maximal bei aktivem Protein und minimal bei inaktivem Protein (siehe hierzu auch 3.4). QAktHyd wurde nach Gl. 3.3 mit der Differenzextinktion der αGTP- und αGDP-Bande (∆E), der Anzahl von Aminosäuren n und der Fläche der AmidII-Bande (A(AmidII)) berechnet und zum Vergleich der Hydrolysemessungen verwendet. QAktHyd = (∆E × n)/A(AmidII)

(3.3)

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3 Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 3.24: Nukleotidaustausch von membrangebundenem Ras. Der Nukleotidaustausch wurde nach dem in Tab. 3.5 beschriebenen Ablaufschema durchgeführt und die Referenzspektren (Ref.) der jeweiligen Phasen in Puffer gemessen. A: Der Austausch wurde anhand von charakteristischen Differenzbanden verfolgt. B: Die einzelnen Phasen des Ablaufs sind farbcodiert dargestellt. Das BeF− 3 -Signal (1) zeigt den Gesamtanteil an GDP-gebundenem Ras. Anhand der α-Differenzbande in EDTA+GTPPuffer (2) lässt sich der Nukleotidaustausch verfolgen, das α-Differenzsignal in Puffer (3) entspricht der Zunahme des Anteils von GTP-gebundenem Ras seit dem letzten Referenzspektrum (Ref.).

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3 Ergebnisse und Diskussion

3.5.3 Ergebnisse 3.5.3.1 Nukleotidaustausch Nach Variation einiger den Nukleotidaustausch bestimmender Parameter war es möglich das GDP des membrangebundenen Ras nach dem in Tab. 3.5 aufgeführten Ablaufschema gegen GTP auszutauschen. Als besonders wichtig hat sich hierbei herausgestellt, dass während der Inkubation mit EDTA immer Nukleotid vorhanden sein muss, da das Protein sonst irreversibel denaturiert (Daten nicht gezeigt). Diese Denaturierung konnte durch eine starke Zunahme von Banden bei 1623 und 1688 cm−1 , die charakteristisch für Proteinaggregate sind, nachgewiesen werden. Die Irreversibilität zeigte sich darin, dass sich von Ras in diesem Zustand auch nach mehrstündiger Inkubation mit GDP kein BeF− 3 -Differenzspektrum mehr messen liess. Mit dem optimierten Austauschprotokoll (Tab. 3.5) konnte jedoch innerhalb von 30 min ein Differenzspektrum des RasON GTPund RasOF F GDP-Zustands gemessen werden (Abb. 3.24A). Der zeitliche Verlauf des Nukleotidaustausches wurde hierbei anhand der α-Differenzbande von RasON GTP und RasOF F GDP (GTP-Differenzsignal) verfolgt (Abb. 3.24). Als Marker für den Anteil von GDP-gebundenem Ras wurde vor und nach jedem Nukleotidaustauschschritt ein BeF− 3 -Differenzspektrum erzeugt. Dabei sollte das Differenzssignal je kleiner sein, desto weniger GDP-gebundenes Ras vorhanden ist. Die BeF− 3 -Differenzextinktion verringerte sich durch die erste Inkubation mit EDTA+GTP von 4,5×10−4 auf 1,5×10−4 . Dies zeigt, dass nach 10 min Inkubation bereits 66 % des Ras GTP-gebunden waren (Abb. 3.24B), was einem GTP-Differenzsignal von 3,3×10−4 entsprach. Im folgenden Austauschzyklus bei Inkubation mit EDTA+GTP über eine Dauer von 20 min veringerte sich das BeF− 3Differenzsignal von 1,9×10−4 auf 0,7×10−4 , und die GTP-Differenzextinktion stieg um zusätzliche 1,4×10−4 an. Ein weiterer 40 minütiger Austausch veringerte das BeF− 3 -Differenzsignal von 1,2×10−4 auf 0,6×10−4 , wobei die GTP-Differenzextinktion um 1,0×10−4 anstieg. Auffällig ist die Erhöhung der BeF− 3 -Signals bei den direkt aufeinander folgenden BeF− 3 -Inkubationen. Da die GTP-Differenzextinktion während den 10 minütigen Pufferinkubationen unverändert blieb, also kein Hydrolyse ablief, kann die Erhöhung − des BeF− 3 -Signals nur dadurch erklärt werden, dass BeF3 die GTP-Hydrolyse beschleu-

nigt. Gemessen am BeF− 3 -Signal konnten durch die 70 minütige Inkubation mit EDTA+GTP insgesamt 87 % des membrangebundenen Ras in den GTP-Zustand gebracht werden. Dies entspricht einer aufsummierten und um den jeweiligen durch BeF− 3 verursachten Rückgang korrigierten GTP-Differenzextinktion von 4,8×10−4 . In nachfolgenden Experimenten ohne BeF− 3 -Test wurde die Kinetik der GTP-Differenzbande während der

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3 Ergebnisse und Diskussion

Inkubation mit EDTA+GTP verfolgt und so festgestellt, dass das Protein nach 60 min vollständig GTP-gebunden ist (Daten nicht gezeigt). Nach der Etablierung des Nukleotidaustausches wurde die GTP-Hydrolyse von Ras untersucht. Hierzu wurde ein Nukleotidaustausch wie in Tab. 3.5 beschrieben durchgeführt, bei dem die Inkubationszeit mit EDTA+GTP auf 60 min verlängert wurde. Es wurden vier Hydrolyseexperimente an der selben Probe durchgeführt, und die Hydrolyse (Puffer nach EDTA+GTP) über 4 h, 4 h, 12 h und 2 h verfolgt. Da die Differenzsignale sehr geringe Extinktionen von 10−4 - 10−5 aufwiesen, und die Messungen über bis zu 12 h verliefen, waren die Einflüsse von Messartefakten recht hoch. Folgende Einflüsse konnten in den Spektren als Störungen erkannt werden: Basislinienverkippungen und verbiegungen, Wasserdampfbanden, Proteindissoziation vom SSLB, δ(OH2 )- und ν(OH)Differenzbanden von Wasser und Silikonspacerbanden. Zusammen mit dem Hydrolysesignal sind dies sieben Effekte, die sich alle unterschiedlich auf die Spektren auswirken. Da diese Störsignale jedoch andere Spektren und Zeitverläufe als die Hydrolyse besitzen, wurde die Methode der multivariaten Kurvenanpassung mit alternierender least squares Optimierung (MCR-ALS) angewandt, um die Störsignale vom Proteinsignal zu trennen (2.7). Da die Anpassung mit einer zu grossen Anzahl von Komponenten zu einer Überanpassung der Daten führen kann (overfit), wurde die MCR-ALS-Auswertung mit einer unterschiedlichen Anzahl von Komponenten durchgeführt. Die Ergebnisse der Anpassungen wurden nach folgenden Kriterien beurteilt: • Die charakteristischen Banden jedes Komponentenspektrums sollten nur in dem jeweiligen Spektrum vorkommen, d.h. dass z.B. das Hydrolysesignal nicht durch mehrere, sondern nur durch ein Spektrum beschrieben sein sollte. Dazu gehört auch, dass die Spektren keine vorzeichenvertauschten Kopien voneinander sein sollten. Hierzu wurden die Spektren jeweils untereinander und mit bekannten puren Spektren von den o.g. Prozessen verglichen. • Das Extinktionsprofil des Hydrolysesignals sollte vier absinkende Extinktionen beschreiben, da dies schon in den Rohdaten zu erkennen war. • Als weiteres Kriterium für eine gute Anpassung wurde ein geringes Rauschen im Hydrolysespektrum und in der Hydrolysekinetik gewertet. Zusätzlich zu diesen Kriterien wurden die Standardabweichung (SD, zwischen modelliertem 3D-Spektrum und Rohdaten-3D-Spektrum), der Fehler der Anpassung relativ zum

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3 Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 3.25: Startwerte für die MCR-ALS Auswertung. Vier Hydrolysereaktionen wurden an derselben Probe gemessen und die 3D-Spektren global angepasst. Als Startwerte für die Anpassung wurden korrigierte Extinktionsverläufe der α(GTP-GDP)-Differenzbande (GTP-Hydrolyse), einer Wasserdampfbande und der Basislinienverkippung vorgegeben. Vor den jeweiligen Hydrolysemessungen wurde ein Referenzspektrum aufgenommen und danach ein Nukleotidaustausch zu GTP (Markierungen 1, 2, 3 und 4) wie im Text beschrieben durchgeführt.

Experiment (LoF(exp), Lack of Fit) und zur PCA (LoF(PCA)) und das Bestimmtheitsmass (R2 ) bei verschiedener Komponentenanzahl verglichen. Unter Beachtung dieser Kriterien wurde die Anpassung der 3D-Spektren zusammen mit den Extinktionsverläufen der drei offensichtlichsten Prozesse, Hydrolyse (αGTP - αGDPDifferenzbande), Basislinienverkippung (Extinktion bei 2030 cm−1 ) und Wasserdampfkonzentrationsänderung (Extinktion der Bande bei 1734 cm−1 ) als Startwerte begonnen (Abb. 3.25). Danach wurde die Anzahl der Startkomponenten schrittweise bis auf sechs erhöht, wobei die zusätzlichen drei Komponenten aus normalverteilten Zufallszahlen (SD = 5×10−6 ) bestanden. Die Extinktionsverläufe, die für die Anpassung verwendet wurden, sind in Abb. 3.25 gezeigt. Die Verläufe der Basislinienverkippung und der Wasserdampfbanden waren unabhängig vom Probensignal und auch in jeder Messung verschieden. So weisst z.B. Messung 2 die geringsten Basislinienschwankungen auf und nur bei Messung 3 ist der Wasserdampfgehalt nicht konstant. Es ergaben sich also in allen vier Messungen Störungssignale mit jeweils unterschiedlichen Verläufen. Dies ermöglichte in der globalen Auswertung der Daten die Störungen als unabhängige Komponenten zu identifizieren

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3 Ergebnisse und Diskussion

und vom Hydrolysesignal zu trennen.

Abbildung 3.26: Exinktionsprofil der MCR-ALS-Auswertung von vier Hydrolysemessungen. Erst ab fünf Komponenten bestand das Ergebnis der Anpassung aus vier absinkenden Extinktionsverläufen. Das Hydrolyse- und das Basisliniensignal sind deutlich zu erkennen, das Wasserdampfsignal konnte nicht als Einzelkomponente angepasst werden.

3.5.3.2 Hydrolysespektren Mit der optimalen Anzahl von fünf Komponenten konnte das Spektrum der intrinsischen Hydrolyse von membrangebundenem Ras erfolgreich ermittelt werden. Die Verwendung von weniger Komponenten führte zu einer Verteilung der Hydrolysebanden auf andere Spektren und zu schlechteren Kinetiken als der Ausgangskinetik (Abb. 3.26). Die Verwendung von mehr Komponenten führte zu einem vorzeichenvertauschten und sonst gleichen Spektrenpaar. Der Vergleich der statistischen Werte führte nicht zu einer solch klaren Aussage über die optimale Komponentenanzahl, da die Werte zwischen drei und sechs Komponenten beinahe stetig zu (R2 , LoF(PCA)) oder abnahmen (SD, LoF(exp)). Das extrahierte Hydrolysespektrum wurde zur Rekonstruktion der gemessenen Extinktionen mit der Amplitude der monoexponentiellen Anpassung des Extinktionsverlaufes von Hydrolysemessung 3 multipliziert (3.26). Das Spektrum hat eines hohes Signal-zu-Rauschen und eine αGTP-αGDP-Differenzextinktion, die mit 1,8×10−4 ca. 50 - 100-fach geringer ist, als die von in Lösung gemessen Spektren. Das Spektrum wurde mit zwei Hydrolysespektren von N-Ras in Lösung (N-Ras1-181HisTag, gemessen von Philipp Pinkerneil)

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3 Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 3.27: Hydrolysedifferenzspektrum von membrangebundenem Ras. Zum Vergleich sind zwei Hydrolysespektren von N-Ras1-181 in Lösung (gemessen von Philipp Pinkerneil) und H-Ras1-166 in Lösung (gemessen von Frederick Großerüschkamp) gezeigt. Die Spektren wurde auf gleiche α-Banden Differenzextinktionen skaliert. Hierzu wurde das H-Ras-Spektrum mit einem Faktor von 0,008 und das N-Ras-Spektrum mit einem Faktor von 0,02 skaliert. Der Stern kennzeichnet den, abgesehen von den Intensitätsunterschieden, einzigen signifikanten Unterschied zwischen den Spektren. Das Spektrum von H-Ras stammt von einer sehr konzentrierten Probe, was die Detektion von Banden im Wasserabsorptionsbereich (höherfrequent als 2500 cm−1 ) ermöglicht (Abb. 3.28), aber auch zu Totalabsorption im AmidI-Bereich führt.

und H-Ras in Lösung (H-Ras1-166, gemessen von Frederick Großerüschkamp) verglichen, wobei die Spektren von Ras in Lösung um den Faktor 0,016 (H-Ras) und 0,038 (N-Ras) skaliert wurden, um gleiche α-Bandenextinktionen zu erhalten. Dieser Vergleich ergab, dass alle Bandenpositionen an denselben Stellen liegen (Abb. 3.27). Die Position der für die Hydrolyse charakteristischen Thr35-Differenzbande (Kötting et al. (2007)) liegt in allen drei Spektren bei 1690 cm−1 und auch die übrigen Bandenlagen des Amid-Bereichs sind identisch. Auch die Differenzbanden des Phosphatbereichs (1300 - 1000 cm−1 ) befinden sich an den gleichen Frequenzen wie bei den Hydrolysespektren in Lösung. So liegen die α-Banden bei 1263 cm−1 (GTP) und 1237 cm−1 (GDP), die β-Banden bei 1261 cm−1 und 1193 cm−1 und die γ-Banden bei 1144 cm−1 und 1101 cm−1 . Der einzige signifikante Unterschied zwischen den Spektren ist die fehlende negative Pi -Bande (1078 cm−1 ) des membrangebundenen Proteins. Grund hierfür ist, dass das bei der Hydrolyse entstehende

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3 Ergebnisse und Diskussion

Pi vom Protein dissoziert und bei Transmissionsmessungen im Messvolumen verbleibt, im ATR-Experiment jedoch aus dem evaneszenten Feld diffundiert und aus der Küvette gespült wird. Obwohl die Spektren gleiche Bandenlagen besitzen, ergeben sich für die Bandenintensitäten einige Unterschiede. Die Banden des membrangebundenen Proteins sind im AmidI-Bereich sehr viel intensiver, so ist die Bande bei 1648 cm−1 mehr als 3-mal so gross (mit negativem Vorzeichen) als die von N-Ras in Lösung. Hier muss erwähnt werden, dass das H-Ras Spektrum aufgrund einer sehr konzentrierten Probe kein Signal im AmidI-Bereich und wenig Signal im AmidII-Bereich besitzt. Dieses Spektrum zeigt jedoch Absorptionen im höherfrequenten Spektralbereich (> 2200 cm−1 ), weshalb es als Vergleichspektrum verwendet wird. Ein weiterer Intensitätsunterschied existiert im Phosphatbereich zwischen 1250 und 1050 cm−1 , wo das Spektrum des membrangebundenen Ras eine insgesamt höhere Extinktion aufweist.

Abbildung 3.28: Hydrolysedifferenzspektrum von membrangebundenem Ras inklusive des Wasserabsorptionsbereichs. Zum Vergleich ist ein Hydrolysespektrum von H-Ras1-166 in Lösung (gemessen von Frederick Großerüschkamp) gezeigt, das um den Faktor 0,008 auf eine gleiche α-Banden Differenzextinktionen skaliert wurde.

Da die Datenaufnahme der ATR-Messungen über den gesamten zugänglichen Spektralbereich von 4000 - 900 cm−1 erfolgte, enthält das Hydrolysespektrum auch den sog. Wasserbereich (3600 - 2500 cm−1 ), in dem die Extinktionsänderungen von proteingebundenen

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3 Ergebnisse und Diskussion

Wassermolekülen zu beobachten sind. Abb. 3.28 zeigt den kompletten Spektralbereich im Vergleich zu dem in Lösung gemessenen H-Ras-Spektrum, das allerdings nur bis 2800 cm−1 reicht. Beide Spektren weisen eine positive, breite und wenig intensive Bande bei ca. 2460 cm−1 und eine negative, sehr breite Bande von ca. 2500 bis 3400 cm−1 auf. Im ATR-Spektrum sind noch weitere positive Banden bei 2954, 3206, 3280 und 3500 cm−1 zu erkennen, die innerhalb der breiten negativen Bande liegen. Die Bedeutung dieser Banden ist noch unklar, einige mögliche Ursachen könnten Umgebungsänderungen von aliphatischen Aminosäureseitenketten (2950 - 2850 cm−1 ), AmidA-Absorptionsänderungen (3280 cm−1 ), Änderungen der OH-Schwingungen der Phosphate und Änderungen der proteingebundenen Wassermoleküle sein.

3.5.3.3 Hydrolysekinetik

Abbildung 3.29: Hydrolysekinetik von membrangebundenem Ras und Ras in Lösung. Gezeigt ist die normierte α(GTP-GDP)-Differenzkinetik der Hydrolyse von membrangebundenem Ras (Messung 3 aus Abb. 3.25) und Ras in Lösung zusammen mit ihrer monoexponentiellen Anpassung (rot).

Die Kinetik der GTP-Hydrolyse wurde anhand des Extinktionsverlaufes des in Abb. 3.28 gezeigten Hydrolysespektrums analysiert. Der Extinktionsverlauf war das Ergebnis der globalen Anpassung von vier Messungen (Abb. 3.26). Zur Auswertung der Kinetik wurde jedoch nur der Extinktionsverlauf von Messung 3 verwendet, da nur diese Messung ausreichend lang war, um die Hydrolyse vollständig zu detektieren. Die Kinetik des mem-

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3 Ergebnisse und Diskussion

brangebundenen Ras wurde mit einer Messung von Ras in Lösung (N-Ras1-181StrepHis, 3.5.2) verglichen. Diese Messung wurde bei gleicher Temperatur, in gleichem Puffer und mit zu 93 % GTP-gebundenem N-Ras wie in 3.5.2 beschrieben durchgeführt. Abb. 3.29 zeigt den Extinktionsverlauf von membrangebundenem Ras im Vergleich mit der α(GTP-GDP)-Differenzkinetik von Ras in Lösung, jeweils auf eins normiert. Die monoexponentielle Anpassung der Kinetiken ergab nahezu identische Ratenkonstanten von (7,3 ± 0,1)×10−5 s−1 für das membrangebundene Ras und (5,0 ± 0,1)×10−5 s−1 für Ras in Lösung. Dies zeigt, dass die intrinsische Hydrolyse nicht bzw. kaum durch die Membranimmobilisierung beeinflusst ist. Da die Hydrolysekinetik durch inaktives Ras verfälscht sein könnte, wurde für beide Proben der Aktivitätsquotient QAktHyd nach Gl. 3.3 berechnet. Das membrangebundene Ras hatte eine AmidII-Fläche von 0,73 cm−1 , eine α-Bandendifferenzextinktion von 4,8×10−4 (Abb. 3.24) und besitzt 188 As, was einen QAktHyd von 0,123 cmAs ergibt. Das lösliche Protein besaß eine AmidII-Fläche von 0,38 cm−1 , eine α-Bandenextinktion von 3,5×10−4 und 196 As. womit sich ein QAktHyd von 0,182 cmAs berechnet. Dieser 1,5-fach geringere Aktivitätsquotient kann bedeuten, dass das membrangebundene Ras bereits zu 34 % inaktiv ist oder dass der Nukleotidaustausch unvollständiger war als bei Ras in Lösung. Da der Unterschied jedoch relativ gering ist, zeigt dieser Vergleich zunächst, dass beide Proteine in ähnlichen Zuständen vorliegen und dass die Berechnung von QAktHyd ein gute Möglichkeit zum Vergleich verschiedener Proteinproben bietet.

3.5.4 Diskussion Im Rahmen der zuvor beschriebenen Experimente konnte der Nukleotidaustausch von membrangebundenem Ras etabliert und ein Hydrolysespektrum von hoher Qualität gemessen werden. Das Spektrum war im AmidI- und AmidII- sowie im Phosphat-bereich bis auf geringe Intensitätsunterschiede identisch zu den in Lösung gemessenen. Auch die Bandenlagen stimmten mit denen von publizierten Hydrolysespektren überein (Kötting et al. (2007, 2008)). Die Ratenkonstanten der intrinsischen Hydrolyse an der Membran und in Lösung unterschieden sich kaum, denn das membrangebundene Ras war lediglich um den Faktor 1,2 schneller. So konnte gezeigt werden, dass die Membranimmobilisierung keinen Einfluss auf intrinsische Hydrolyse von Ras hat. Ein Vorteil der ATR-Technik ist die durch das evaneszente Feld begrenzte Schichtdicke. Dies verhindert die in Transmissionsmessungen durch Wasserschichten > 10 µm

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3 Ergebnisse und Diskussion

verursachte Totalabsorption und ermöglicht so die gleichzeitige Analyse des AmidI-, des Phosphat- und des Wasserabsorptions-Bereichs. So konnten in dieser Arbeit zum ersten mal Differenzbanden der GTP-Hydrolyse von Ras im Wasserbandenbereich zwischen 3700 und 2500 cm−1 gemessen werden (Abb. 3.28). Die Differenzbanden bestehen aus zwei breiten positiven Banden bei 3500 und 2460 cm−1 , einer sehr breiten negativen Bande zwischen 3400 und 2500 cm−1 , einer grossen schmalen Bande bei 3280 cm−1 und mehreren kleinen Banden. Ein Erklärungsansatz für dieses Bandenmuster ergibt sich aus den Wasserabsorptionsbanden. Die Absorption von bulk-Wasser liegt bei 3600 cm−1 (νas (OH)) und 3450 cm−1 (νs (OH)) und verschiebt bei Ausbildung von starken H-Brücken in Richtung niederfrequent, wobei sich die Absorptionsbande durch Kopplung mit der Umgebung verbreitert (Pimentel und McCellan (1960)). Demnach könnte die breite negative Bande zwischen 3500 und 2500 cm−1 durch eine Abnahme der H-Brücken zwischen H2 O und Ras hervorgerufen sein. Die positive Bande bei 3500 cm−1 entspräche somit der Zunahme von bulk-Wasser. Diese Erklärung wird durch die Kenntnis der 3D-Strukturen von RasON GTP (1QRA) und RasOF F GDP (1CRP) gestützt, da Ras im OFF-Zustand durch die sehr flexiblen Switch-Regionen dem Solvens eine größere Oberfläche bietet, als im geschlossenen ON-Zustand (Vetter und Wittinghofer (2001)). Eine grössere Oberfläche führt dabei zu mehr H-Brücken mit H2 O und könnte somit die Ursache für die o.g. Unterschiede in den Banden für bulk- und H-Brücken gebundenes H2 O sein. Die wenig intensive positive Bande bei 2460 cm−1 könnte demnach durch die Verstärkung von H-Brücken einiger weiterhin Ras-gebundener H2 O-Moleküle verursacht sein. Die Intensitätsunterschiede der Hydrolysespektren von membrangebundenem Ras und Ras in Lösung könnten durch die in Abschnitt 3.2 beschriebene Orientierung des Proteins im Bezug zur Membran verursacht sein. So kann das Hydrolysespektrum des membrangebundenen Ras als ein Summenspektrum von Hydrolyse- und Orientierungsdifferenzspektrum angesehen werden. Es wurden bereits Orientierungsänderungen von H-Ras beim Übergang zwischen GTP- und GDP-Zustand postuliert (Gorfe et al. (2007a); Abankwa et al. (2008)), die sich jedoch auf methodisch umstrittene MD-Simulationen stützen (Persönliche Mitteilung, Till Rudack und Henrick te Heesen, LS Biophysik, Ruhr Universität Bochum). Bei diesen Orientierungsänderungen dreht sich die G-Domäne um ca. 90 °, so dass die α-Helices 3, 4 und 5 im GDP-Zustand senkrecht und im GTP-Zustand parallel zur Membran ausgerichtet sind (3.2, 1.5.3). Diese Orientierungsänderung würde zu einem Dichroitischen Differenzspektrum mit einer Maximalextinktionen von 0,002 führen (vgl. Abb. 3.11). Da dies ca. 10-fach mehr ist, als die hier gemessenen Differenzextinktionen kann davon ausgegangen werden, das in diesen Experimenten keine derart grosse

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3 Ergebnisse und Diskussion

Orientierungsänderung stattfand. Allerdings ist auch nicht auszuschliessen, dass in den vorliegenden Experimenten der GTP-GDP-abhängige Orientierungswechsel durch eine zu hohe Oberflächenkonzentration oder das Fehlen von negativ geladenen Membranlipiden unmöglich war. Daher ist es in zukünftigen Experimenten geplant, dichroitische Hydrolysespektren in Abhängigkeit von der Oberflächenbeladung und verschiedenen Lipidzusammensetzungen des SSLBs aufzunehmen. Zum Vergleich der hier ermittelten Hydrolysekinetiken von Ras liegen nur wenige bei 20 °C gemessene Literaturwerte vor. Da jedoch die Temperaturabhängigkeit der Hydrolysereaktion bereits bekannt ist (Kötting und Gerwert (2004)), wurden einige Literaturwerte auf 20 ° umgerechnet. Dabei ergaben sich Ratenkonstanten, die zwischen 4,1×10−5 s−1 (Yamasaki et al. (1994)) und 8,4×10−5 s−1 (John et al. (1989)) liegen und somit gut mit den hier ermittelten Werten von 5,0×10−5 s−1 (Lösung) und 7,3×10−5 s−1 (Membran) übereinstimmen. In dieser Arbeit wurde die Membranimmobiliserung von Ras und der Nukleotidaustausch des gebundenen Proteins etabliert, was es nun ermöglicht, auch von onkogenen Mutanten wie RasG12V oder Q61-Mutanten GTP-GDP-Differenzspektren zu messen und damit Informationen über den Bindungszustand des Triphosphats und das Verhältnis von OFF zu ON Zustand zu erhalten. Weiterhin ist es nun erstmals möglich, in kurzer Zeit (ca. 1h) Differenzspektren zwischen zwei Ras-Zuständen mit jeglicher Nukleotidbeladung z.B. isotopen- oder fluoreszenzmarkierte Nukleotiden zu erhalten. Das ermöglicht es Differenzspektren eine ganzen Reihe von unterschiedlichen Nukleotiden in wenigen Stunden an derselben Probe zu messen und eröffent somit völlig neue Möglichkeiten der FTIRspektroskopischen Untersuchung von GTPasen.

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3 Ergebnisse und Diskussion

3.6 Protein-Protein Interaktion von membrangebundenem Ras mit NoreRBD 3.6.1 Das Ras Effektorprotein Nore1A Das Protein Nore1A (Novel Ras Effector 1A, UniprotID: Q8WWW0-1) ist ein Effektorprotein der GTPase Ras. Nore1A hat eine Länge von 418 As., ein molekulare Masse von 47,1 kDa und besitzt drei Proteindomänen. In der Nähe des N-Terminus befindet sich eine membranbindende C1-Domäne, auch Cysteinreiche Domäne genannt (CRD, As. 122 - 170), die Zinkionen komplexiert und das Second Messenger-Membranlipid Diacylglycerol (DAG) bindet (Abb. 3.30). Weiter C-terminal liegt die Ras-bindende Domäne (RBD, As. 274 - 364) und am C-Terminus liegt eine Coiled Coil-Domäne (CC, As. 366 - 413), über die Nore1A mit sich selbst oder anderen Proteinen oligomerisieren kann.

Abbildung 3.30: Domänenaufbau von Nore1A. Nore1A besitzt eine C1-Domäne (Cysteinreiche Domäne (CRD) die über Diacylglycerol (DAG) Membranbindung vermittelt, eine Ras-bindende Domäne (RBD) und eine Coiled Coil-Domäne (SARAH-Domäne, Sav/RASSF/Hpo Interaktions Domäne), über die Nore1A mit anderen Proteinen oligomerisiert. (verändert nach Stieglitz et al. (2008))

Zusätzlich zur Interaktion mit Ras interagiert NoreRBD in vitro auch mit Rap1B, Rap2A, R-Ras, R-Ras2 (TC21) und R-Ras3 (M-Ras) (Wohlgemuth et al. (2005); Ortiz-Vega et al. (2002); Miertzschke et al. (2007)). Bei Nore1A handelt es sich vermutlich um ein Tumorsuppressorprotein, da seine Expression in zahlreichen Tumorzelllinien aufgrund von Promotormethylierungen unterdrückt ist und eine ektopische Expression zu einem verringerten Wachstum führt (Richter et al. (2009)). Die tumorsupprimierende Wirkung wird vermutlich durch Oligomerisierung mit der Serin/Threonin-Kinase MST1 und die RasGTP-abhängige Membranlokalisation hervorgerufen. Durch die Membrannähe kommt es bei MST1 zur Abspaltung einer autoinhibitorischen Proteindomäne durch die Protease Caspase 3. Das nun katalytisch aktive MST1 gelangt in den Zellkern und löst dort durch Histon-Phosphorylierung Apoptose aus (de Souza und Lindsay (2004); Richter et al. (2009)). In diesem Projekt sollte die Möglichkeit etabliert werden, Protein-Protein Interaktion von membranbebundenen Proteinen mit ATR-FTIR zu untersuchen und quantitative Ergebnisse über die Affinität und Kinetik der Interaktion zu erhalten. Exemplarisch für eine Ras-Effektor-Interaktion sollte die Frage beantwortet werden, inwiefern die Affinität

114

3 Ergebnisse und Diskussion

und Kinetik der Ras-NoreRBD-Interaktion durch die Membranimmobiliserung von Ras beeinflusst wird.

3.6.2 Durchführung Für die Messungen wurde die NoreRDB-Mutante E217K verwendet (Nore1A-RBD, As. 199-358, E217K), die von Daniel Filchtinski (Lehrstuhl Physikalische Chemie 1, Fakultät für Chemie, Ruhr Universität Bochum) zur Verfügung gestellt wurde. Für die Mutation E217K wurde kein Effekt auf die Interaktion mit Ras festgestellt (persönliche Mitteilung Daniel Filchtinski), weshalb sie im folgenden dem Wildtypprotein gleichgesetzt wird. Als Grundlage für das NoreRBD-Experiment wurde zuerst ein SSLB durch Vesikelspreitung generiert (3.1), das lipidierte N-Ras an der Oberfläche immobilisiert (3.2) und dessen Aktivität durch den BeF− 3 induzierten Übergang vom OFF- in den ON-Zustand sichergestellt (3.4). Das Protein wurde aus einer 0,75 µM Stocklösung (Puffer D + BeF− 3 ) durch einen Mischer im Durchfluss auf 0,1; 0,2; 0,3 und 0,4 µM verdünnt und mit 1 ml/min für 10 min durch die Küvette gepumpt. Nach der Assoziation erfolgte die Dissoziation durch einen 50 minütigen Waschschritt mit Puffer D + BeF− 3 . Während der NoreRBD-Anbindung und des Waschschrittes wurden im Abstand von 25 s Spektren gegen Puffer D + BeF− 3 als Referenz aufgenommen. Die Messungen wurden nach dem in Tab. 3.7 wie in Abschnitt 2.4 beschrieben unter Standard-ATR-Messbedingungen durchgeführt, für die Probenspektren wurden 100 Scans, für das Referenzspektrum 1000 Scans gemittelt. Vor jeder Inkubation mit NoreRBD wurde die Oberfläche 5 min mit BeF− 3 -freiem Puffer gespült und nach dem Wechsel zum BeF− 3 Puffer ein OFF/ON-Differenzspektrum des immobilisierten Ras so wie in 3.4 beschrieben aufgenommen. Dies sollte Aufschluss darüber geben, ob immer gleich viel Ras im ON-Zustand für die Interaktion mit NoreRBD zur Verfügung steht. Die Kinetiken der Assoziation und Dissoziation wurden einzeln exponentiell angepasst und die apparenten Assoziationsraten (kobs ) gegen die NoreRBD-Konzentration aufgetragen. Aus dieser Auftragung wurde die Assoziationsratenkonstante kass durch lineare Anpassung der Daten mit Gl. 3.4 ermittelt (Schuck und Minton (1996)). Mit kass und dem aus der Dissoziation bestimmten Dissoziationsratenkonstante kdiss wurde die Dissoziationskonstante mit KD(kin) = kdiss / kass berechnet. Zum Vergleich wurde die KD(eq) aus den Gleichgewichtsextinktionen (Amplituden der monoexponentiellen Anpassung)

115

3 Ergebnisse und Diskussion

Tabelle 3.7: Messablauf der NoreRBD-Messung

Step 1 2 3 4 5 6

ta

%Ab

%B

%C

%D

%E

Flowc

4 100 1 3 100 1 3,6 100 1 10 100-x x 1 50 100 1 Schleife → gehe zu Step1 mit anderem x

Tod

Scanse

tspec f

Refg

W W W W W

200 200 1000 100 100

1 1 1 25 25

X X

Reservoirdefinitionen A: Puffer D B: Puffer D; 4 mM BeF2 ; 16 mM NaF C: Puffer D; 4 mM BeF2 ; 16 mM NaF; 0,5 µM NoreRBD D: E: a b c d e f g

Dauer der Schrittes (min) %-Anteil der gepumpten Puffer der verschiedenen Reservoire Flussrate der Schlauchpumpe (ml/min) Ziel des Duchflussvolumens (W steht für waste, Abfall) Scans pro Spektrum Wartezeit zwischen zwei Spektren (s) X steht für die Messung eines Referenzspektrums

der NoreRBD-Anbindungen nach Gl. 3.5 berechnet, wobei Emax dem Extinktionswert bei maximaler Oberflächenabsättigung mit NoreRBD entspricht. kobs = kass × c(N oreRBD) + kdiss E(c(N oreRBD)) =

(3.4)

c(N oreRBD) × Emax KD(eq) + c(N oreRBD)

(3.5)

Zusätzlich zu dieser Art der Auswertung wurden die Assoziationskinetiken mit der sog. integrierten Ratengleichung (Gl. 3.6) global angepasst, wobei sich Werte für kass und kdiss direkt aus der Anpassung ergeben. E(t, c(N oreRBD)) = Emax × (1 − e−(kass(int) ×c(N oreRBD)+kdiss(int) )(t−t0 ) )

(3.6)

Aus den Ratenkonstanten der integrierten Ratengleichung wurde die Dissoziationskonstante mit KD(int) = kdiss(int) / kass(int) berechnet.

116

3 Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 3.31: NoreRBD-Anbindung an membrangebundenes Ras. A: 3D-Spektrum der ATR-FTIRMessung von 2000 - 1000 cm−1 . B: Spektren der Assoziation der ersten Anbindung bei 0,3 µM NoreRBD. C: Kinetiken der NoreRBD-Assoziation und -Dissoziation. Aufgetragen ist eine gemittelte Extinktion im Bereich des Maximums der AmidII-Bande von 1550 - 1545 cm−1 .

3.6.3 Ergebnisse Die vor jeder NoreRBD-Anbindung gemessen Differenzspektren wiesen β-Bandendifferenzextinktionen von 2,7×10−4 bei 0,3 µM, 2,4×10−4 bei 0,1 µM, 2,6×10−4 bei 0,4 µM und 2,5×10−4 bei 0,2 µM auf. Da in der zuvor durchgeführten Titration mit BeF− 3 (Daten nicht gezeigt) ein theoretischer Maximalwert der β-Bandendifferenzextinktion (∆Emax ) von 3,7×10−4 ermittelt wurde, bedeutet dies, dass ca. 70 % des aktivierbaren membrangebundenen Ras bei den NoreRBD-Anbindungen im ON-Zustand war. Die AmidII-Bandenfläche des immobilisierten Proteins vor Zugabe von NoreRBD lag bei 0,264 cm−1 bei 0,3 µM, 0,266 cm−1 bei 0,1 µM, 0,266 cm−1 bei 0,4 µM und 0,27 cm−1 bei 0,2 µM NoreRBD. Hieraus ergibt sich zusammen mit ∆Emax nach Gl. 3.2 ein QAktBeF x von 0,26 cmAs. Bei Annahme eines maximalen QAktBeF x von 0,35 cmAs (siehe 3.4.3.2) bedeutet dies, dass ca. 75 % des gebundenen Proteins aktiv waren.

117

3 Ergebnisse und Diskussion

In den Messungen konnte eine konzentrationsabhängige Immobilisierung von NoreRBD an der Oberfläche beobachtet werden. Die Rohdaten der Messungen von allen vier NoreRBD-Konzentrationen wurden mit den Stützpunktregionen 2700 - 2680 cm−1 und 1860 - 1850 cm−1 basislinienkorrigiert und sind in Abb. 3.31A im Bereich von 2000 1000 cm−1 als 3D-Spektrum dargestellt. Die Extinktion der AmidI- und AmidII-Banden des gebundenen NoreRBD liegt mit 1,5×10−3 deutlich über dem Rauschen von ca. 2×10−5 womit sich ein S/N (Signal-Rausch-Verhältnis) von 75 ergibt. Die Amid-Banden von verschiedenen Zeitpunkten der Assoziationskinetik unterschieden sich nur in der Intensitiät, nicht aber in der Form (Daten nicht gezeigt). Dies zeigt, dass während der Anbindung nur ein Prozess zeitlich aufgelöst werden konnte, also keine Orientierungsänderung oder Umfaltung des anbindenden NoreRBD zu detektieren war. Zur weiteren Analyse der Protein-Protein Interaktion wurde die Kinetik des Maximums der AmidIIBande bei 1548 cm−1 (Abb. 3.31B) extrahiert, wobei zur Rauschunterdrückung der Bereich von 1550 - 1545 cm−1 gemittelt wurde (Abb. 3.31C). Die AmidII-Extinktionsverläufe (Abb. 3.32) weisen bis ca. 600 s bei allen vier NoreRBDKonzentrationen einen starken Anstieg auf, wobei die Extinktionen einen minmalen Wert von 0,9×10−3 bei 0,1 µM und einen maximalen Wert von 1,3×10−3 bei 0,4 µM aufweisen. Auffällig ist, dass das AmidII-Signal bei 0,3 und 0,4 µM zwischen 500 und 600 s kaum noch ansteigt, sich also das Gleichgewicht zwischen gelöstem und Ras-gebundenem NoreRBD nahezu eingestellt hat. Die Assoziationsphase von 70 - 580 s lies sich monoexponentiell angepassen wobei die Anpassung Ratenkonstanten kobs von 4,1×10−3 s−1 bei 0,1 µM, 5×10−3 s−1 bei 0,2 µM, 7,3×10−3 s−1 bei 0,3 µM und 8,2×10−3 s−1 bei 0,4 µM NoreRBD ergab. Die Assoziationsratenkonstate kass wurde durch eine lineare Regression der Auftragung der einzelnen kobs -Werte gegen die NoreRBD-Konzentration berechnet (Abb. 3.33A) und ergab einen Wert von (1,47 ± 0,09)×10−2 µM−1 s−1 . Die Dissoziationsratenkonstante entspricht dem y-Achsenabschnitt der Regression und liegt bei kdiss(ass) = (2,52 ± 0,26)×10−3 s−1 (Abb. 3.33A). Aus der globalen Anpassung der Assoziationskinetik mit der integrierten Ratengleichung ergaben sich ähnliche Werte von kass(int) = (1,57 ± 0,07)×10−2 µM−1 s−1 und kdiss(int)) = (2,2 ± 0,2)×10−3 s−1 . In der Waschphase, die von 600 - 3600 s dauerte, ging das AmidII-Signal auf unter 2×10−3 bei 0,1 und 0,2 µM und auf 6×10−3 bei 0,3 und 0,4 µM zurück. Da sich die Dissoziationskinetiken nur schlecht monoexponentiell anpassen liessen (Abb. 3.32), wurden zwei Exponentialfunktionen benutzt, um die Dissoziationsratenkonstanten zu extrahieren. Da die Ratenkonstanten in unabhängigen Anpassungen nahe beieinander lagen (Daten nicht gezeigt), konnte eine globale Anpassung der Daten durchgeführt werden. Hierbei wur-

118

3 Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 3.32: Anbindung von NoreRBD an membrangebundenes Ras. Aufgetragen ist die basislinienkorrigierte AmidII-Extinktion bei 1547 cm−1 wie in Abb. 3.31C gezeigt. Die Anbindungen wurden nacheinander an demselben Ras-Monolayer durchgeführt, wobei jeweils vor Zumischung von NoreRBD ein Referenzspektrum gemessen wurde. Der Zeitpunkt des Referenzspektrums wurde für jede Anbindung als t = 0 gesetzt. Nach 500 - 600 s (grau unterlegte Bereich) ist das Gleichgewicht der Anbindung annähernd erreicht. Die Assoziationsphase wurde monoexponentiell und mit einer integrierten Ratengleichung (3.6) global angepasst. Die Dissoziationsphase wurde mono- und biexponentiell angepasst, die Werte der Anpassungen finden sich in Abb. 3.33 und Tab. 3.8. Ras wurde während den Messungen durch BeF− 3 haltigen Puffer im ON-Zustand gehalten und nach jeder Messung durch Spülen mit BeF− 3 -freiem Puffer wieder in den OFF-Zustand gebracht.

den die Ratenkonstanten als globale Parameter gesetzt um die Amplituden mit größerer Genauigkeit als bei der monoexponentiellen Anpassung bestimmen zu können. Die globale Anpassung ergab Ratenkonstanten von (4,7 ± 0,2)×10−3 s−1 für kdiss1 und (1,1 ± 0,06)×10−3 s−1 für kdiss2 . Um herauszufinden welche der beiden Raten den Prozess des Komplex-Zerfalls von Ras und NoreRBD wiederspiegelt, wurden die Amplituden beider Raten gegen die Konzentration aufgetragen (Abb. 3.33B). Hierbei zeigte sich, dass die schnellere Rate kdiss1 mit 0,08 - 0,017 die größeren Amplituden und zusätzlich eine Konzentrationsabhängigkeit aufwies. Die Amplituden von kdiss2 waren mit 0,006 - 0,009 ca. 10-fach kleiner und bei allen NoreRBD-Konzentrationen annähernd gleich groß. Der Unterschied der Amplituden zeigt, dass der größte Anteil des Ras-NoreRBD-Komplexes mit kdiss1 zerfällt, weshalb es sich hierbei um die gesuchte Dissoziationsratenkonstante handeln muss. Die langsamere Rate kdiss2 könnte durch andere Prozesse wie z.B. eine schwache Interaktion von NoreRBD mit dem Lipidbilayer zustandkommen.

119

3 Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 3.33: A: Bestimmung von kass und kdiss durch lineare Regression. B: Konzentrationsabhängige Amplituden der globalen biexponentiellen Anpassung der Dissoziationskinetiken aus Abb. 3.32. C: Bestimmung von KD(eq) über die Anpassung der konzentrationsabhängigen Gleichgewichtsextinktionen. Als Gleichgewichtsextinktionen wurden die Amplituden der monoexponentiellen Anpassung der Assoziation (Abb. 3.32) verwendet.

Die Dissoziationskonstante KD der NoreRBD-Interaktion mit membrangebundenen Ras wurde auf drei verschiedende Weisen ermittelt. Die einzelnen Anpassungen des Assoziation und Dissoziation ergaben einen Wert von KD (kin) =kdiss1 /kass = 0,32 ± 0,075 µM. Die Anpassung mit der integrierten Ratengleichung ergab KD(int) = kdiss(int) /kass(int) = 0,14 ± 0,057 µM und die Equilibriumsdissoziationskonstante, die nach Gl. 3.5 berechnet wurde, hatte einen Wert von KD(eq) = 0,2 ± 0,07 µM (Abb. 3.33C). Die berechneten Werte liegen in der gleichen Größenordnung (Tab. 3.8) und weichen lediglich um einen Faktor von 2 voneinander ab.

120

3 Ergebnisse und Diskussion

Tabelle 3.8: Kinetische und thermodynamische Daten der Interaktion von NoreRDB mit membrangebundenem Ras. Verschiedene Arten der Auswertung von Assoziations- und Dissoziationskinetiken ergeben ähnliche Werte für kass , kdiss und kD .

kass kdiss KD a b c

µM−1 s−1 s−1 µM

Einzelna

Integriertb

Gleichgewichtc

(1,47 ± 0,09)×10−2 (4,7 ± 0,2)×10−3 0,32 ± 0,075

(1,57 ± 0,07)×10−2 (2,2 ± 0,02)×10−3 0,14 ± 0,057

0,2 ± 0,07

Einzelne Exponentielle Anpassung der Assoziation und Dissoziation. Anpassung der Assoziation mit integrierter Ratengleichung (Gl. 3.6). Berechnung des KD nach Gl. 3.5 aus Gleichgewichtsextinktionen.

3.6.4 Diskussion In diesem Projekt konnte erfolgeich die Interaktion von NoreRBD mit membrangebundenem Ras untersucht werden. Aus den Assoziationskinetiken liess sich ein Wert von 0,002 für das maximal zu erreichende Nore-AmidII-Signal abschätzen. Dieser Wert kann mit dem theoretisch maximalen Wert verglichen werden, der sich aus der AmidII-Extinktion des immobilisierten Ras (0,0078), der molekularen Masse beider Proteine (Ras: 21 kDa, NoreRBD: 18 kDa), dem Anteil des ON-Zustandes der aktivierbaren Ras-Moleküle (70%) und dem Anteil des aktiven Ras (75 %) berechnen lässt. Für diese theoretisch maximale AmidII-Bande von NoreRBD lässt ein Wert von 0,0078 × 18 kDa / 21 kDa × 70% × 75% = 0,0035 berechenen, der somit 1,75-fach höher ist, als gemessene Wert. Eine mögliche Erklärung für diesen Abweichung ist, dass die Oberfläche des SSLBs zu 60 - 80% mit Ras-Proteinen belegt ist (3.2), und daher an vielen der immobilisierten Ras-Moleküle eine Anbindung von NoreRBD sterisch behindert sein könnte. Ein weitere Faktor könnte die grössere Entfernung des NoreRBD zur Oberfläche sein. Für den verwendeten Aufbau (Germanium-IRE, H2O, Probenfilm « dp ) eingibt sich nach Gl. 2.5 eine Eindringtiefe (1/e = 37 %) von 386 nm. Mit der Eindringtiefe kann die elektrische Feldstärke E(z) abhängig vom Abstand zur Oberfläche nach Gl. 2.4 berechnet werden. Ausgehend von einer Feldstärke von 1 bei 0 nm ergeben sich somit Werte von 0,988 bei 5 nm und 0,95 bei 20 nm. Wenn NoreRBD 20 nm und Ras 5 nm von der Oberfläche entfernt wären, würde die AmidII-Bande von NoreRBD demnach 3,8 % kleiner sein. Um die gewonnenen Daten auf ihre Konsistenz hin zu prüfen wurden zwei von Schuck und Minton (1996) vorgeschlagene Tests durchgeführt. Zum Einen sollte die kdiss(ass) , die aus der Auftragung von kobs gegen c(NoreRBD) durch lineare Regression als yAchsenabschnitt gewonnen wurde, gleich der kdiss aus der Dissoziation, zumindest je-

121

3 Ergebnisse und Diskussion

doch positiv sein (Schuck und Minton (1996)). Dieses Kriterium ist hier mit kdiss(ass) = 2,52×10−3 s−1 und kdiss = 4,7×10−3 s−1 erfüllt. Weiterhin sollte die aus den Kinetiken ermittelte KD(kin) und die aus den Gleichgewichtsextinktionen ermittelten KD(eq) den gleichen Wert aufweisen. Auch hierbei ergaben sich für KD(kin) = 0,32 µM und KD(eq) = 0,2 µM ähnliche Werte, was für die Validität der Auswertung spricht. Untersuchungen der Interaktion von NoreRBD mit doppelt palmitoyliertem H-Ras, das an lipidierten Nanopartikeln gebunden war, ergaben KD -Werte von 0,45 µM an der Membran und 0,3 µM für die Interaktion in Lösung (Filchtinski et al. (2008)). Diese Werte wurde bei 37 °C gemessen und entsprechen somit den in dieser Arbeit bei 20 °C ermittelten KD -Werten von 0,32 und 0,2 µM im Rahmen der Messgenauigkeit. Ein grosser Unterschied besteht jedoch in den Assoziations- und Dissoziations-Ratenkonstanten, die mit Stopped-Flow-Technik zu kass = 1,5 µM−1 s−1 und kdiss = 0,15 s−1 bestimmt wurden (Filchtinski et al. (2008)), und dieser Arbeit mit kass = 1,47×10−2 µM−1 s−1 und kdiss = 4,7×10−3 s−1 jeweils 100-fach geringer waren. Allerdings haben die Autoren bei der Assoziation einen zusätzlichen 15 - 20-fach langsameren Prozess beobachtet, der eine ähnlich große Amplitude wie die zur Auswertung verwendete Rate aufwiess. Dies wurde als die Interaktion von NoreRBD mit einer zweiten evtl. anders ausgerichteten Population von Ras Molekülen diskutiert. Es ist bekannt, dass geringere kass - und kdiss -Werte durch crowding-Effekte auf der Oberfläche oder Massentransportphenomäne zustande kommen können (Schuck (1996)). Diese Effekte können die Ratenkonstanten zwar um den Faktor 10 - 100 verringern, der Quotient KD = kdiss /kass wäre jedoch nicht beeinflusst. Damit ergeben sich für die Verlangsamung der Ratenkonstanten drei Erklärungsansätze. Erstens könnte eine zu hohe Ras-Oberflächenkonzentration, entsprechend dem crowding-Effekt, die Ursache sein. Zweitens könnte die vermutete Dimersierung des membrangebundenen Ras die Nore-RBD-Interaktion beeinflussen und drittens könnte die Systemträgheit des Durchflusssystems die Ursache sein. Der Einfluss der Systemträgheit, die sich aus der Geometrie der Durchflusszelle und der Flussrate ergibt, wurde nachfolgend untersucht.

3.6.5 Einfluss der Transportkinetik auf die Anbindungskinetiken Die Zeitauflösung von Durchfluss-Messsystemen ist meist durch die Geschwindigkeit des Flüssigkeitsaustausches bestimmt. In diesen Fällen ist das Messsignal eine Faltung des Probensignals mit einer sog. Transferfunktion, die die Systemträgheit repräsentiert (Garcia-Celma et al. (2008)). Die Transferfunktion ist hierbei die erste Ableitung der Flüssigkeitsaustauschkinetik, der sog. Transportkinetik.

122

3 Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 3.34: Einfluss der Transferfunktion auf die NoreRBD-Anbindungskinetik. A: Die Trägheit des Durchflusssystems wurde durch Aufnahme einer Extinktionskinetik von NaN3 bestimmt. Die NaN3 Kinetik wurde durch eine Transportkinetik angepasst. B: Durch Ableitung der Transportkinetiken ergeben sich die Transferfunktion. C: Zur Simulation der Transporteffekte wurde eine Exponentialfunktion mit der angepassten und einer langsameren Transferfunktion gefaltet. Die Ergebnisse der Faltung wurden monoexponentiell angepasst und die erhaltenen Zeitkonstanten mit der Ursprungs-Exponentialfuktion verglichen. D: Kinetiken der NoreRBD-Anbindung dargestellt mit gleicher x-Achsen Skalierung wie die Simulationen.

Um zu prüfen, wie stark die vorliegenden Ergebnisse durch die Transferfunktion beeinflusst sind, wurde die Extinktionskinetik eines Reportermoleküls beim Einstrom in und beim Ausstrom aus der ATR-Küvette gemessen (Abb. 3.34A). Als Reportermolekül wurde Natriumazid (NaN3 , 10 mM) verwendet, das sich durch eine starke IR-Absorption bei isolierten Bandenlage bei 2049 cm−1 auszeichnet. Die Kinetik repräsentiert demnach die zeitliche Entwicklung der NaN3 -Konzentration im evaneszenten Feld, die nur von den Eigenschaften des Durchflusssystems, wie z.B. der Flussrate, dem Schlauchdurchmesser und der Schlauchlänge, dem internen Volumen und der Anzahl der durchflossenen Ventile und der Küvettengeometrie bestimmt ist. Die so gemessene Transportkinetik wurde durch eine Gompertz Funktion angepasst (Abb. 3.34A), aus der durch Bildung der ersten

123

3 Ergebnisse und Diskussion

Ableitung die Transferfunktion (Abb. 3.34B) berechnet wurde. (−k(x−xc)) )

f (x) = Ae(−e

(3.7)

Die Gompertz-Funktion (Abb. 3.34A, Gl. 3.7) wurde gewählt, weil sie sich gut zur Anpassung der Daten eignete und nicht aufgrund eines möglichen zugrundeliegenden Modells. Mit dieser Funktion konnten nachfolgend unterschiedliche Transportkinetiken rauschfrei und mit beliebiger x-Achsenauflösung simuliert werden. Da die NoreRBD-Anbindungsdaten eine zu geringe Zeitauflösung im Vergleich zu denen der Transportkinetik haben, konnten die Daten nicht miteinander entfaltet werden. Um den Einfluss der Transportkinetik auf die exponentiellen Anpassungen trotzdem abzuschätzen, wurde eine Exponentialfunktion (At = A0 e−t/τ mit A0 = 1 und τ = 100 s) mit der ermittelten Transferfunktion und einer langsameren Transferfunktion gefaltet (Abb. 3.34C). Praktisch wurde dies durch Anwendung des „convolve“-Befehls des Programmes Matlab (R2006b, The MathWorks) erreicht. Bei der monoexponentiellen Anpassung der Faltungsergebnisse zeigte sich, dass die frühen Zeitbereiche stark durch die Faltung deformiert waren, weshalb Faltung 1 ab 90 s und Faltung 2 ab 180 s angepasst wurde. Die Anpassung ergab Werte für τ von 101 s bei Faltung 1 und 112 s bei Faltung 2, was im Vergleich mit der ursprünglichen Exponentialfunktion 1% bzw. 12% langsamer ist. Dies zeigt, dass die Assoziations- und Dissoziationsraten der NoreRBD-Anbindung an das immobilisierte Ras durch die Flüssigkeitsaustauschkinetik (Transferfunktion 1) um lediglich 1% verlangsamt würden (Abb. 3.34D). Daher kann man die Systemträgheit als Ursache für die langsameren Zeitkonstanten vernachlässigen.

3.6.6 Fazit In diesem Projekt wurde die quantitative ATR-FTIR-Untersuchung von Protein-ProteinInteraktionen mit membrangebundenem Ras etabliert. Es konnte eine Dissoziationskonstante von 0,2 bzw. 0,32 µM für die Ras-NoreRBD-Interaktion ermittelt werden, was in Einklang mit bislang veröffentlichten Werten steht. Interessanterweise finden sich bislang keine Publikationen in denen diese Technik so wie in dieser Arbeit, analog zu SPR-Spektroskopie-Biosensorsystemen (z.B. Biacore) verwendet wurde. Dabei besitzt die Technik den großen Vorteil, dass keine Labels wie z.B Trp-Mutanten oder fluoreszierende Nukleotide benötigt werden, so wie es bei Stopped Flow Messungen der Fall ist. Die Methode ist derart sensitiv, dass bei einer bimolekularen Interaktion von zwei Proteinen

124

3 Ergebnisse und Diskussion der gleichen Größe (z.B. 20 kDa) ab einer Oberflächenbeladung von ca. 1 pmol/cm2 ausreichend hohe Signalstärken von 1×10−3 erreicht werden, um Bindungsaffinitäten auch bei höheren kass zu bestimmen. Hierzu muss allerdings die Geometrie der Durchflusszelle optimiert werden, damit Austauschzeiten von unter einer Sekunde möglich werden. Da bei der ATR-FTIR-Spektroskopie mit spektraler Auslösung gemessen wird, kann im Gegensatz zu Biacore auch die Interaktion mit kleineren Molekülen z.B. Peptiden oder Pharmaka analysiert werden, insofern sie zur Verschiebung von Absorptionsbanden führt (siehe 3.4). Ein weitere Vorteil, der sich aus der spektralen Auflösung in Kombination mit lineardichroitischen Messungen ergibt, ist die Möglichkeit Struktur- und Orientierungsänderungen der interagierenden Proteine aufzuklären.

125

4 Zusammenfassung und Ausblick Zunächst wurde die Herstellung festkörpergestützter Lipidmembranen auf dem internen Reflektionselement etabliert. Die Charakterisierung dieser aus POPC bestehenden Lipidmembranen ergab, dass es sich um einzelne, lückenlose, planare Doppelmembranen mit der für POPC-Membranen charakteristischen Schichtdicke und Fluidität handelt. Die Inkubation der erzeugten Membranen mit lipidiertem Ras führte zu einer sehr langsamen ca. 10 h dauernden Proteinimmobilisierung, nach deren Ende 60–80 % der Membranoberfläche mit Ras-Proteinen belegt war. Die Untersuchung des Bindungsmodus zeigte, dass das Protein wie im nativen Zustand über den Lipidanker mit der Membran interagiert. Mit Hilfe der hier durchgeführten Experimente gelang zudem erstmals der Nachweis einer orientierten Membranbindung von Ras, bei der der überwiegende Teil seiner α-Helices eher senkrecht zur Membran orientiert ist. In weiterführenden Arbeiten kann jetzt der Einfluss von putativ membraninteragierenden Residuen auf die Orientierung von Ras untersucht werden. Auch Membranen unterschiedlicher Ladungs- oder Phasenzustände, die durch Verwendung von unterschiedlichen Lipiden erzeugt werden können, könnten im Rahmen weiterer Experimente wertvolle Hinweise auf die Ursache der orientierten Anbindung geben. Die Sekundärstrukturanalyse des membrangebundenen Ras zeigte, dass die Membrananbindung nur geringfügige Auswirkungen auf die Proteinstruktur hat. Zudem konnten durch die Sekundärstrukturanalyse Hinweise darauf erhalten werden, daß der Lipidanker vorwiegend in β-Sheet-Struktur vorliegt. Nachdem sowohl Immobilisierung als auch Orientierung und Sekundärstruktur des membrangebundenen Ras charakterisiert wurden, wurde zur funktionellen Charakterisierung des Proteins die Differenzspektroskopie etabliert. Die vorliegenden Ergebnisse sind die ersten bekannten Beschreibungen Liganden-induzierter Differenzspektren von ProteinMonolagen, die ohne Oberflächenverstärkungseffekte gemessen wurden. Durch Inkubation von GDP-gebundenem Ras mit dem γ-Phosphat-Analogon BeF− 3 konnten Differenzspektren zwischen ON- und OFF-Zustand erzeugt werden. Die Spektren wiesen keine

126

4 Zusammenfassung und Ausblick

signifikanten Unterschiede zu denen von Ras in Lösung auf. Dies lässt auf eine gleiche Konformation der Nukleotidbindetasche von membrangebundenem und löslichem Protein schliessen. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde die Inkubation mit BeF− 3 als Aktivitätsnachweis des immobilisierten Proteins genutzt. Aufbauend auf den differenzspektroskopischen Methoden wurde der Nukleotidaustausch des membrangebundenen Proteins etabliert und so die Untersuchung der GTP-Hydrolyse von Ras ermöglicht. Die Kinetik der intrinsischen Hydrolyse und das Hydrolysedifferenzspektrum von membrangebundenem Ras wiesen nur geringe Unterschiede zu den in Lösung gemessenen Kinetiken und Spektren auf. Dies zeigt, dass weder die Membranimmobilisierung noch die orientierte Anbindung einen Einfluss auf die Nukleotidbindung und Hydrolyseaktivität des membrangebundenen Proteins hat. In zukünftigen Experimenten kann der Nukleotidaustausch von membrangebundenem Ras zur differenzspektroskopischen Analyse z.B. von onkogenen Ras-Mutanten genutzt werden, die bislang nicht mit FTIR-Spektroskopie untersucht werden konnten. Durch die Verwendung von isotopenmarkierten Nukleotiden könnte die Zuordnung aller Phosphatbanden durch Messung am selben immobilisierten Protein erfolgen, und so die probenabhängige Varianz eliminiert werden. Weiterhin ermöglicht der Nukleotidaustausch die Quantifizierung des ON- zu OFF-Verhältnisses von verschiedenen Mutanten und bei Bindung von unterschiedlichen Nukleotiden. Eine Besonderheit der gemessenen Hydrolysespektren ist die hervorragende Signalqualität im Bereich der Wasserabsorptionsbanden, wodurch es in zukünftigen Messungen möglich sein wird, den Einfluss von Wassermolekülen auf die Hydrolyse-Reaktion zu untersuchen. In ersten Experimenten zur Protein-Protein-Interaktion von membrangebundenem Ras mit Effektoren zeigte sich, dass die Membranimmobilisierung keinen Einfluss auf die Affinität zum Effektor NoreRBD hat. Die ATR-Technik wurde hiermit erstmalig analog zu SPR-Spektroskopie-Biosensorsystemen eingesetzt und eröffnet nun die Möglichkeit, andere Interaktionspartner wie Effektoren, GAPs und GEFs, sowie Modulatoren dieser Interaktionen wie small molecules zu untersuchen. Besonders interessant ist in diesem Zusammenhang die Analyse des GEF-induzierten Nukleotidaustausches, der bisher in Transmissionsmessungen nicht untersucht werden konnte. Abschließend ist festzustellen, dass das hier untersuchte membrangebundene Ras eine vergleichbare Konformation und Aktivität aufweist wie Ras in Lösung, da wesentliche Parameter wie z.B. die Sekundärstruktur, die intrinsische GTP-Hydrolyse und die Effek-

127

4 Zusammenfassung und Ausblick

torinteraktion ähnlich sind. Weiterhin wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmals gezeigt, dass das Protein spezifisch ausgerichtet an der Membran gebunden ist. In dieser Arbeit wurde die ATR-FTIR-spektroskopische Untersuchung von membrangebundenem Ras erfolgreich etabliert. Diese Methode ermöglicht nun die Bearbeitung einer Vielzahl von interessanten Fragestellungen.

128

Abkürzungen Å

Ångström, 10−10 m

Abb.

Abbildung

ATR

Abgeschwächte Totalreflektion

As.

Aminosäure

BeF− 3

Beryllium-3-fluorid

BeFx

Berylliumfluorid

BSA

Rinderserumalbumin (bovine serum albumin)

°C

Grad Celsius

cm

Zentimeter

cm−1

Wellenzahl

δ

Biegeschwingung

∆

Differenz

Da

Dalton

DTT

Dithiothreitol

EDTA

Ethylendiamintetraessigsäure

E. coli

Escherichia coli

FTIR

Fouriertransformiert, Infrarot

FWHH

Full Width at Half Height, volle Halbwertsbreite einer Bande

g

Gramm

GAP

Guanin-Nukleotid-aktivierende Protein

GDP

Guanosin-5’-diphosphat

GEF

Guaninnukleotid-Austausch-Faktor

G-Domäne

Guanosin-Nukleotid-bindende Domäne

G-Protein

Guanosin-Nukleotid-bindendes Protein

h

Stunde

IR

Infrarot

IRE

Internes Reflektionselement

k

Kilo–

129

Abkürzungen

L

Liter

M

molar

m

Milli–

NaN3

Natriumazid

NMR

Nuclear Magnetic Resonance, Kernspinresonanzspektroskopie

NTA

Nitrilo-Tri-Essigsäure

µ

Mikro–

min

Minute

n

Nano-

p

Pico-

POPC

Palmitoyl-Oleyl-Phosphatidylcholin

RBD

Ras-Binde-Domäne

RMSD

Root Mean Square Deviation, Wurzel der mittleren quadratischen Abweichung

rpm

revolutions per minute, Umdrehungen pro Minute

RT

Raumtemperatur

s

Sekunde

SUV

Small Unilamellar Vesicle, kleiner Vesikel mit einzelner Membran

SSLB

Solid Supported Lipid Membrane, Festkörper-gestützte Lipidmembran

Tab.

Tabelle

Tris

Tris-hydroxymethyl-aminomethan

UV

Ultraviolett

z. B.

zum Beispiel

Für Aminosäuren wurden die üblichen Ein- und Drei-Buchstabenabkürzungen verwendet.

130

5 Literaturverzeichnis Abankwa, D., Hanzal-Bayer, M., Ariotti, N., Plowman, S. J., Gorfe, A. A., Parton, R. G., McCammon, J. A., and Hancock, J. F. (2008). A novel switch region regulates H-ras membrane orientation and signal output. EMBO J, 27(5):727– 735. Allin, C., Ahmadian, M. R., Wittinghofer, A., and Gerwert, K. (2001). Monitoring the GAP catalyzed H-Ras GTPase reaction at atomic resolution in real time. Proc Natl Acad Sci U S A, 98(14):7754–7759. Arrondo, J. L., Muga, A., Castresana, J., and ni, F. M. G. (1993). Quantitative studies of the structure of proteins in solution by Fourier-transform infrared spectroscopy. Prog Biophys Mol Biol, 59(1):23–56. Bader, B., Kuhn, K., Owen, D. J., Waldmann, H., Wittinghofer, A., and Kuhlmann, J. (2000). Bioorganic synthesis of lipid-modified proteins for the study of signal transduction. Nature, 403(6766):223–226. Barth, A. (2000). The infrared absorption of amino acid side chains. Prog Biophys Mol Biol, 74(3-5):141–173. Bechinger, B., Ruysschaert, J. M., and Goormaghtigh, E. (1999). Membrane helix orientation from linear dichroism of infrared attenuated total reflection spectra. Biophys J, 76(1 Pt 1):552–563. Braach-Maksvytis, V. L. and Cornell, B. A. (1988). Chemical shift anisotropies obtained from aligned egg yolk phosphatidylcholine by solid-state 13C nuclear magnetic resonance. Biophys J, 53(5):839–843. Brauner, J. W., Flach, C. R., and Mendelsohn, R. (2005). A quantitative reconstruction of the amide I contour in the IR spectra of globular proteins: from structure to spectrum. J Am Chem Soc, 127(1):100–109.

131

5 Literaturverzeichnis Brian, A. A. and McConnell, H. M. (1984). Allogeneic stimulation of cytotoxic T cells by supported planar membranes. Proc Natl Acad Sci U S A, 81(19):6159–6163. Brunsveld, L., Kuhlmann, J., and Waldmann, H. (2006). Synthesis of palmitoylated Ras-peptides and -proteins. Methods, 40(2):151–165. Byler, D. M. and Susi, H. (1986). Examination of the secondary structure of proteins by deconvolved FTIR spectra. Biopolymers, 25(3):469–487. Cepus, V., Scheidig, A. J., Goody, R. S., and Gerwert, K. (1998). Time-resolved FTIR studies of the GTPase reaction of H-ras p21 reveal a key role for the betaphosphate. Biochemistry, 37(28):10263–10271. de Souza, P. M. and Lindsay, M. A. (2004). Mammalian Sterile20-like kinase 1 and the regulation of apoptosis. Biochem Soc Trans, 32(Pt3):485–488. Díaz, J. F., Escalona, M. M., Kuppens, S., and Engelborghs, Y. (2000). Role of the switch II region in the conformational transition of activation of Ha-ras-p21. Protein Sci, 9(2):361–368. Díaz, J. F., Sillen, A., and Engelborghs, Y. (1997). Equilibrium and kinetic study of the conformational transition toward the active state of p21Ha-ras, induced by the binding of BeF3- to the GDP-bound state, in the absence of GTPase-activating proteins. J Biol Chem, 272(37):23138–23143. Downward, J. (2003). Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy. Nat Rev Cancer, 3(1):11–22. Efremov, A., Mauro, J. C., and Raghavan, S. (2004). Macroscopic model of phospholipid vesicle spreading and rupture. Langmuir, 20(14):5724–5731. Esteban, L. M., Vicario-Abejón, C., Fernández-Salguero, P., FernándezMedarde, A., Swaminathan, N., Yienger, K., Lopez, E., Malumbres, M., McKay, R., Ward, J. M., Pellicer, A., and Santos, E. (2001). Targeted genomic disruption of H-ras and N-ras, individually or in combination, reveals the dispensability of both loci for mouse growth and development. Mol Cell Biol, 21(5):1444–1452. Filchtinski, D., Bee, C., Savopol, T., Engelhard, M., Becker, C. F. W., and Herrmann, C. (2008). Probing ras effector interactions on nanoparticle supported lipid bilayers. Bioconjug Chem, 19(9):1938–1944.

132

5 Literaturverzeichnis Frey, B. J., Leviton, D. B., and Madison, T. J. (2006). Temperature-dependence refractive index of silicon and germanium. Proc. SPIE, 6273, 62732J. Fringeli, U. P., Baurecht, D., Siam, M., Reiter, G., Schwarzott, M., Bürgi, T., and Brüesch, P. (2002). ATR spectroscopy of thin films. Handbook of thin film materials, H. S. Nalwa, Academic Press, London, 2: Characterization and spectroscopy of thin films. Frishman, D. and Argos, P. (1995). Knowledge-based protein secondary structure assignment. Proteins, 23(4):566–579. Garcia-Celma, J. J., Dueck, B., Stein, M., Schlueter, M., Meyer-Lipp, K., Leblanc, G., and Fendler, K. (2008). Rapid activation of the melibiose permease MelB immobilized on a solid-supported membrane. Langmuir, 24(15):8119–8126. Gasper, R., Scrima, A., and Wittinghofer, A. (2006).

Structural insights

into HypB, a GTP-binding protein that regulates metal binding.

J Biol Chem,

281(37):27492–27502. Ghosh, A., Praefcke, G. J. K., Renault, L., Wittinghofer, A., and Herrmann, C. (2006). How guanylate-binding proteins achieve assembly-stimulated processive cleavage of GTP to GMP. Nature, 440(7080):101–104. Gilman, A. G. (1987). G proteins: transducers of receptor-generated signals. Annu Rev Biochem, 56:615–649. Goormaghtigh, E., Cabiaux, V., and Ruysschaert, J. M. (1994a). Determination of soluble and membrane protein structure by Fourier transform infrared spectroscopy. I. Assignments and model compounds. Subcell Biochem, 23:329–362. Goormaghtigh, E., Cabiaux, V., and Ruysschaert, J. M. (1994b). Determination of soluble and membrane protein structure by Fourier transform infrared spectroscopy. II. Experimental aspects, side chain structure, and H/D exchange. Subcell Biochem, 23:363–403. Goormaghtigh, E., Cabiaux, V., and Ruysschaert, J. M. (1994c). Determination of soluble and membrane protein structure by Fourier transform infrared spectroscopy. III. Secondary structures. Subcell Biochem, 23:405–450. Goormaghtigh, E., Raussens, V., and Ruysschaert, J. M. (1999). Attenuated total reflection infrared spectroscopy of proteins and lipids in biological membranes. Biochim Biophys Acta, 1422(2):105–185.

133

5 Literaturverzeichnis Goormaghtigh, E. and Ruysschaert, J. M. (1990). Polarized attenuated total reflection infrared spectroscopy as a tool to investigate the conformation and orientation of membrane components. Molecular Description of Biological Membranes by Computer-Aided Conformational Analysis (ed. R. Brasseur), I.B.3:285–329. Gorfe, A. A., Babakhani, A., and McCammon, J. A. (2007a). Free energy profile of H-ras membrane anchor upon membrane insertion. Angew Chem Int Ed Engl, 46(43):8234–8237. Gorfe, A. A., Hanzal-Bayer, M., Abankwa, D., Hancock, J. F., and McCammon, J. A. (2007b). Structure and dynamics of the full-length lipid-modified H-Ras protein in a 1,2-dimyristoylglycero-3-phosphocholine bilayer. J Med Chem, 50(4):674– 684. Güldenhaupt, J., Adigüzel, Y., Kuhlmann, J., Waldmann, H., Kötting, C., and Gerwert, K. (2008). Secondary structure of lipidated Ras bound to a lipid bilayer. FEBS J, 275(23):5910–5918. Gustafsson, J. P. (2009). Visual MINTEQ version 2.61. Dep. LandWater Res. Eng., Stockholm, Sweden. Hancock, J. F. (2003). Ras proteins: different signals from different locations. Nat Rev Mol Cell Biol, 4(5):373–384. Harrick, N. J. (1967). Internal Reflection Spectroscopy. Interscience, New York. Henis, Y. I., Hancock, J. F., and Prior, I. A. (2009). Ras acylation, compartmentalization and signaling nanoclusters (Review). Mol Membr Biol, 26(1):80–92. Herrmann, C. (2003). Ras-effector interactions: after one decade. Curr Opin Struct Biol, 13(1):122–129. Inouye, K., Mizutani, S., Koide, H., and Kaziro, Y. (2000). Formation of the Ras dimer is essential for Raf-1 activation. J Biol Chem, 275(6):3737–3740. Jackson, M. and Mantsch, H. H. (1995). The use and misuse of FTIR spectroscopy in the determination of protein structure. Crit Rev Biochem Mol Biol, 30(2):95–120. Jaumot, J., Gargallo, R., de Juan, A., and Tauler, R. (2005). A graphical user-friendly interface for MCR-ALS: a new tool for multivariate curve resolution in MATLAB. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 76(1):101 – 110.

134

5 Literaturverzeichnis Jaumot, J., Vives, M., and Gargallo, R. (2004). Application of multivariate resolution methods to the study of biochemical and biophysical processes. Anal Biochem, 327(1):1–13. John, J., Schlichting, I., Schiltz, E., Rösch, P., and Wittinghofer, A. (1989). C-terminal truncation of p21H preserves crucial kinetic and structural properties. J Biol Chem, 264(22):13086–13092. Kötting, C., Blessenohl, M., Suveyzdis, Y., Goody, R. S., Wittinghofer, A., and Gerwert, K. (2006). A phosphoryl transfer intermediate in the GTPase reaction of Ras in complex with its GTPase-activating protein. Proc Natl Acad Sci U S A, 103(38):13911–13916. Kötting, C. and Gerwert, K. (2004). Time-resolved FTIR studies provide activation free energy, activation enthalpy and activation entropy for GTPase reactions. Chemical Physics, 307(2-3):227 – 232. The Physics of Protein Folding and Function. Kötting, C., Kallenbach, A., Suveyzdis, Y., Eichholz, C., and Gerwert, K. (2007). Surface change of Ras enabling effector binding monitored in real time at atomic resolution. Chembiochem, 8(7):781–787. Kötting, C., Kallenbach, A., Suveyzdis, Y., Wittinghofer, A., and Gerwert, K. (2008). The GAP arginine finger movement into the catalytic site of Ras increases the activation entropy. Proc Natl Acad Sci U S A, 105(17):6260–6265. Kraulis, P. J., Domaille, P. J., Campbell-Burk, S. L., Aken, T. V., and Laue, E. D. (1994). Solution structure and dynamics of ras p21.GDP determined by heteronuclear three- and four-dimensional NMR spectroscopy. Biochemistry, 33(12):3515– 3531. Krimm, S. and Bandekar, J. (1986). Vibrational spectroscopy and conformation of peptides, polypeptides, and proteins. Adv Protein Chem, 38:181–364. Kuhn, K., Owen, D. J., Bader, B., Wittinghofer, A., Kuhlmann, J., and Waldmann, H. (2001). Synthesis of functional Ras lipoproteins and fluorescent derivatives. J Am Chem Soc, 123(6):1023–1035. Leekumjorn, S. and Sum, A. K. (2007). Molecular characterization of gel and liquidcrystalline structures of fully hydrated POPC and POPE bilayers. J Phys Chem B, 111(21):6026–6033.

135

5 Literaturverzeichnis Lenzen, C., Cool, R. H., Prinz, H., Kuhlmann, J., and Wittinghofer, A. (1998). Kinetic analysis by fluorescence of the interaction between Ras and the catalytic domain of the guanine nucleotide exchange factor Cdc25Mm. Biochemistry, 37(20):7420–7430. Lórenz-Fonfría, V. A., Granell, M., León, X., Leblanc, G., and Padrós, E. (2009). In-plane and out-of-plane infrared difference spectroscopy unravels tilting of helices and structural changes in a membrane protein upon substrate binding. J Am Chem Soc, 131(42):15094–15095. Marsh, D. (1999). Quantitation of secondary structure in ATR infrared spectroscopy. Biophys J, 77(5):2630–2637. Marsh, D., Müller, M., and Schmitt, F. J. (2000). Orientation of the infrared transition moments for an alpha-helix. Biophys J, 78(5):2499–2510. Mavarani, L. (2009). Biophysikalische Untersuchungen an GTPasen, insbesondere Ras. Diplomarbeit, Lehrstuhl für Biophysik, Fakultät für Biologie und Biotechnologie, Ruhr Universität Bochum. Max, J.-J. and Chapados, C. (2009). Isotope effects in liquid water by infrared spectroscopy. III. H2O and D2O spectra from 6000 to 0 cm(-1).

J Chem Phys,

131(18):184505. Meister, A., Nicolini, C., Waldmann, H., Kuhlmann, J., Kerth, A., Winter, R., and Blume, A. (2006). Insertion of lipidated Ras proteins into lipid monolayers studied by infrared reflection absorption spectroscopy (IRRAS). Biophys J, 91(4):1388–1401. Mesmer, R. E. and Baes, C. F. (1969). Fluoride complexes of beryllium(II) in aqueous media. Inorganic Chemistry, 8(3):618–626. Metropolis, N. and Ulam, S. (1949). The Monte Carlo method. J Am Stat Assoc, 44(247):335–341. Miertzschke, M., Stanley, P., Bunney, T. D., Rodrigues-Lima, F., Hogg, N., and Katan, M. (2007). Characterization of interactions of adapter protein RAPL/Nore1B with RAP GTPases and their role in T cell migration. J Biol Chem, 282(42):30629–30642. Morigaki, K. and Tawa, K. (2006). Vesicle fusion studied by surface plasmon resonance and surface plasmon fluorescence spectroscopy. Biophys J, 91(4):1380–1387.

136

5 Literaturverzeichnis Nagele, E., Schelhaas, M., Kuder, N., and Waldmann, H. (1998). Chemoenzymatic Synthesis of N-Ras Lipopeptides. Journal of the American Chemical Society, 120(28):6889–6902. Nicolini, C., Baranski, J., Schlummer, S., Palomo, J., Lumbierres-Burgues, M., Kahms, M., Kuhlmann, J., Sanchez, S., Gratton, E., Waldmann, H., and Winter, R. (2006). Visualizing association of N-ras in lipid microdomains: influence of domain structure and interfacial adsorption. J Am Chem Soc, 128(1):192–201. Ollesch, J. (2006). Entwicklung und Anwendung zeitaufgelöster Fourier-TransformInfrarot-spektroskopischer Sekundärstrukturanalyse an ausgewählten Proteinen. Dissertation, Lehrstuhl für Biophysik, Fakultät für Biologie und Biotechnologie, Ruhr Universität Bochum. Ollesch, J., Künnemann, E., Glockshuber, R., and Gerwert, K. (2007). Prion protein alpha-to-beta transition monitored by time-resolved Fourier transform infrared spectroscopy. Appl Spectrosc, 61(10):1025–1031. Omerovic, J. and Prior, I. A. (2009). Compartmentalized signalling: Ras proteins and signalling nanoclusters. FEBS J, 276(7):1817–1825. Ortiz-Vega, S., Khokhlatchev, A., Nedwidek, M., feng Zhang, X., Dammann, R., Pfeifer, G. P., and Avruch, J. (2002). The putative tumor suppressor RASSF1A homodimerizes and heterodimerizes with the Ras-GTP binding protein Nore1. Oncogene, 21(9):1381–1390. Pimentel, G. C. and McCellan, A. L. (1960). The Hydrogen Bond. W. H. Freeman and Company, San Franciso and London. Pinkerneil, P. (2009). Etablierung und ATR-FT-IR spektroskopische Untersuchung der Affnitäts-Tag-Immobilisierung von Ras auf Festkörper-gestützten Lipidmembranen. Diplomarbeit, Lehrstuhl für Biophysik, Fakultät für Biologie und Biotechnologie, Ruhr Universität Bochum. Plowman, S. J., Ariotti, N., Goodall, A., Parton, R. G., and Hancock, J. F. (2008). Electrostatic interactions positively regulate K-Ras nanocluster formation and function. Mol Cell Biol, 28(13):4377–4385. Plowman, S. J. and Hancock, J. F. (2005). Ras signaling from plasma membrane and endomembrane microdomains. Biochim Biophys Acta, 1746(3):274–283.

137

5 Literaturverzeichnis Prior, I. A., Harding, A., Yan, J., Sluimer, J., Parton, R. G., and Hancock, J. F. (2001). GTP-dependent segregation of H-ras from lipid rafts is required for biological activity. Nat Cell Biol, 3(4):368–375. Raedler, J., Strey, H., and Sackmann, E. (1995). Phenomenology and Kinetics of Lipid Bilayer Spreading on Hydrophilic Surfaces. Langmuir, 11(11):4539–4548. Rand, R. P. (1981). Interacting Phospholipid Bilayers: Measured Forces and Induced Structural Changes. Annual Review of Biophysics and Bioengineering, 10(1):277–314. Reimhult, E., Höök, F., and Kasemo, B. (2003). Intact Vesicle Adsorption and Supported Biomembrane Formation from Vesicles in Solution: Influence of Surface Chemistry, Vesicle Size, Temperature, and Osmotic Pressure. Langmuir, 19(5):1681– 1691. Reimhult, E., Larsson, C., Kasemo, B., and Höök, F. (2004). Simultaneous surface plasmon resonance and quartz crystal microbalance with dissipation monitoring measurements of biomolecular adsorption events involving structural transformations and variations in coupled water. Anal Chem, 76(24):7211–7220. Reimhult, E., Zäch, M., Höök, F., and Kasemo, B. (2006). A multitechnique study of liposome adsorption on Au and lipid bilayer formation on SiO2. Langmuir, 22(7):3313–3319. Reiter, G., Hassler, N., Weber, V., Falkenhagen, D., and Fringeli, U. P. (2004). In situ FTIR ATR spectroscopic study of the interaction of immobilized human tumor necrosis factor-alpha with a monoclonal antibody in aqueous environment. Biochim Biophys Acta, 1699(1-2):253–261. Reiter, G., Siam, M., Falkenhagen, D., Gollneritsch, W., Baurecht, D., and Fringeli, U. P. (2002). Interaction of a Bacterial Endotoxin with Different Surfaces Investigated by in Situ Fourier Transform Infrared Attenuated Total Reflection Spectroscopy. Langmuir, 18(15):5761–5771. Reuther, G., Tan, K.-T., Köhler, J., Nowak, C., Pampel, A., Arnold, K., Kuhlmann, J., Waldmann, H., and Huster, D. (2006a). Structural model of the membrane-bound C terminus of lipid-modified human N-ras protein. Angew Chem Int Ed Engl, 45(32):5387–5390. Reuther, G., Tan, K.-T., Vogel, A., Nowak, C., Arnold, K., Kuhlmann, J., Waldmann, H., and Huster, D. (2006b). The lipidated membrane anchor of full

138

5 Literaturverzeichnis

length N-Ras protein shows an extensive dynamics as revealed by solid-state NMR spectroscopy. J Am Chem Soc, 128(42):13840–13846. Richter, A. M., Pfeifer, G. P., and Dammann, R. H. (2009). The RASSF proteins in cancer; from epigenetic silencing to functional characterization. Biochim Biophys Acta, 1796(2):114–128. Richter, R., Mukhopadhyay, A., and Brisson, A. (2003). Pathways of lipid vesicle deposition on solid surfaces: a combined QCM-D and AFM study. Biophys J, 85(5):3035–3047. Richter, R. P., Bérat, R., and Brisson, A. R. (2006). Formation of solid-supported lipid bilayers: an integrated view. Langmuir, 22(8):3497–3505. Rocks, O., Peyker, A., Kahms, M., Verveer, P. J., Koerner, C., Lumbierres, M., Kuhlmann, J., Waldmann, H., Wittinghofer, A., and Bastiaens, P. I. H. (2005). An acylation cycle regulates localization and activity of palmitoylated Ras isoforms. Science, 307(5716):1746–1752. Rothschild, K. J. and Clark, N. A. (1979). Polarized infrared spectroscopy of oriented purple membrane. Biophys J, 25(3):473–487. Roy, S., Plowman, S., Rotblat, B., Prior, I. A., Muncke, C., Grainger, S., Parton, R. G., Henis, Y. I., Kloog, Y., and Hancock, J. F. (2005). Individual palmitoyl residues serve distinct roles in H-ras trafficking, microlocalization, and signaling. Mol Cell Biol, 25(15):6722–6733. Schmidbaur, H. (2001). Recent contributions to the aqueous coordination chemistry of beryllium. Coordination Chemistry Reviews, 215(1):223 – 242. Schmidt, M. and Schmidbaur, H. (1998).

Ligand Redistribution Equilibria in

Aqueous Fluoroberyllate Solutions. Zeitschrift für Naturforschung, 53(11):7. Schuck, P. (1996). Kinetics of ligand binding to receptor immobilized in a polymer matrix, as detected with an evanescent wave biosensor. I. A computer simulation of the influence of mass transport. Biophys J, 70(3):1230–1249. Schuck, P. and Minton, A. P. (1996). Kinetic analysis of biosensor data: elementary tests for self-consistency. Trends Biochem Sci, 21(12):458–460.

139

5 Literaturverzeichnis Scrima, A. and Wittinghofer, A. (2006). Dimerisation-dependent GTPase reaction of MnmE: how potassium acts as GTPase-activating element. EMBO J, 25(12):2940– 2951. Seantier, B. and Kasemo, B. (2009). Influence of mono- and divalent ions on the formation of supported phospholipid bilayers via vesicle adsorption. Langmuir, 25(10):5767–5772. Seelig, J. and Seelig, A. (1980). Lipid conformation in model membranes and biological membranes. Quarterly Reviews of Biophysics, 13(01):19–61. Shahinian, S. and Silvius, J. R. (1995). Doubly-lipid-modified protein sequence motifs exhibit long-lived anchorage to lipid bilayer membranes.

Biochemistry,

34(11):3813–3822. Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, M. D., Fujimoto, E. K., Goeke, N. M., Olson, B. J., and Klenk, D. C. (1985). Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem, 150(1):76–85. Stieglitz, B., Bee, C., Schwarz, D., Yildiz, O., Moshnikova, A., Khokhlatchev, A., and Herrmann, C. (2008). Novel type of Ras effector interaction established between tumour suppressor NORE1A and Ras switch II. EMBO J, 27(14):1995– 2005. Takai, Y., Sasaki, T., and Matozaki, T. (2001). Small GTP-binding proteins. Physiol Rev, 81(1):153–208. Tatulian, S. A. (2003). Attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy: a method of choice for studying membrane proteins and lipids. Biochemistry, 42(41):11898–11907. Thapar, R., Williams, J. G., and Campbell, S. L. (2004). NMR characterization of full-length farnesylated and non-farnesylated H-Ras and its implications for Raf activation. J Mol Biol, 343(5):1391–1408. Torii, H. and Tasumi, M. (1992). Model calculations on the amide-I infrared bands of globular proteins. The Journal of Chemical Physics, 96(5):3379–3387. Tucker, J., Sczakiel, G., Feuerstein, J., John, J., Goody, R. S., and Wittinghofer, A. (1986). Expression of p21 proteins in Escherichia coli and stereochemistry of the nucleotide-binding site. EMBO J, 5(6):1351–1358.

140

5 Literaturverzeichnis Umanoff, H., Edelmann, W., Pellicer, A., and Kucherlapati, R. (1995). The murine N-ras gene is not essential for growth and development. Proc Natl Acad Sci U S A, 92(5):1709–1713. Venyaminov, S. Y. and Prendergast, F. G. (1997). Water (H2 O and D2 O) molar absorptivity in the 1000-4000 cm−1 range and quantitative infrared spectroscopy of aqueous solutions. Anal Biochem, 248(2):234–245. Vetter, I. R. and Wittinghofer, A. (2001). The guanine nucleotide-binding switch in three dimensions. Science, 294(5545):1299–1304. Vogel, A., Katzka, C. P., Waldmann, H., Arnold, K., Brown, M. F., and Huster, D. (2005). Lipid modifications of a Ras peptide exhibit altered packing and mobility versus host membrane as detected by 2H solid-state NMR. J Am Chem Soc, 127(35):12263–12272. Vogel, A., Reuther, G., Weise, K., Triola, G., Nikolaus, J., Tan, K.-T., Nowak, C., Herrmann, A., Waldmann, H., Winter, R., and Huster, D. (2009). The lipid modifications of Ras that sense membrane environments and induce local enrichment. Angew Chem Int Ed Engl, 48(46):8784–8787. Weise, K., Triola, G., Brunsveld, L., Waldmann, H., and Winter, R. (2009a). Influence of the lipidation motif on the partitioning and association of N-Ras in model membrane subdomains. J Am Chem Soc, 131(4):1557–1564. Weise, K., Triola, G., Janosch, S., Waldmann, H., and Winter, R. (2009b). Visualizing association of lipidated signaling proteins in heterogeneous membranesPartitioning into subdomains, lipid sorting, interfacial adsorption, and protein association. Biochim Biophys Acta. Wohlgemuth, S., Kiel, C., Krämer, A., Serrano, L., Wittinghofer, F., and Herrmann, C. (2005). Recognizing and defining true Ras binding domains I: biochemical analysis. J Mol Biol, 348(3):741–758. Yamasaki, K., Shirouzu, M., Muto, Y., Fujita-Yoshigaki, J., Koide, H., Ito, Y., Kawai, G., Hattori, S., Yokoyama, S., and Nishimura, S. (1994). Sitedirected mutagenesis, fluorescence, and two-dimensional NMR studies on microenvironments of effector region aromatic residues of human c-Ha-Ras protein. Biochemistry, 33(1):65–73.

141

Abbildungsverzeichnis 1.1

Ras-Regulationszyklus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

7

1.2

Ras-vermittelte Signaltransduktionskaskade . . . . . . . . . . . . . . . . .

8

1.3

3D-Struktur von Ras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

1.4

Unterschiede der C-Termini von Ras-Isoformen . . . . . . . . . . . . . . . 11

1.5

Lokalisation von Ras-Nanoclustern in unterschiedlichen Membrandomänen 14

1.6

Modell der Orientierungsänderung der G-Domäne von Ras. . . . . . . . . 15

1.7

Semisynthetisches N-Ras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

2.1

Schematischer Aufbau von IR-Spektrometern . . . . . . . . . . . . . . . . 30

2.2

Schematische Darstellung des evaneszenten Feldes . . . . . . . . . . . . . . 32

2.3

Zusammenhang zwischen der Polarisation des evaneszenten Feldes und der Polarisation der eingekoppelten IR-Strahlung. . . . . . . . . . . . . . . 34

2.4

Orientierte Spektren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

2.5

Verschachteltes Ordnungsparametermodell . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

2.6

Polarisatorineffizienz des verwendeten Aufbaus . . . . . . . . . . . . . . . 41

2.7

Verwendetes Messsystem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

2.8

Linearität der Mischung mit Ventrobot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

2.9

Aquaspec-Zelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

2.10 Schematische Darstellung der Bandenzerlegung . . . . . . . . . . . . . . . 48 2.11 Prinzip der MCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 3.1

POPC Spektrum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

3.2

Vesikelspreitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

3.3

Verschiedene Interaktionmodi von Vesikeln mit Oberflächen . . . . . . . . 59

3.4

BSA Adsorption . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

3.5

Lineardichroitische Spektren einen POPC-SSLB . . . . . . . . . . . . . . . 61

3.6

Ordnungsparameterkinetik von Vesikelspreitungen . . . . . . . . . . . . . 62

3.7

Spektren der Anbindung von lipidiertem Ras an einen POPC-SSLB

3.8

Anbindung von lipidiertem Ras an einen SSLB . . . . . . . . . . . . . . . 69

142

. . . 68

Abbildungsverzeichnis

3.9

Anbindungen von lipidiertem Ras an einen SSLB . . . . . . . . . . . . . . 70

3.10 Stabilität der Ras-Membran-Interaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71 3.11 Polarisierte Spektren der Ras Anbindung an einen SSLB . . . . . . . . . . 72 3.12 Kinetiken von polarisiert gemessenen Ras-Anbindungen . . . . . . . . . . 75 3.13 Ausrichtungen der G-Domäne im Bezug zur Membran . . . . . . . . . . . 78 3.14 Seitenkettenkorrektur der Absorptionsspektren von Ras . . . . . . . . . . 83 3.15 Zweite Ableitung und FSD der AmidI’-Bande von Ras . . . . . . . . . . . 84 3.16 Bandenzerlegung der AmidI’-Banden von Ras . . . . . . . . . . . . . . . . 85 3.17 Sekundärstruktur der Ankerregion von membrangebundenem Ras . . . . . 88 3.18 Berylliumfluorid induziert den Wechsel vom OFF- in den ON-Zustand . . 91 3.19 Berylliumfluoriddifferenzspektren mit Störungsanteilen . . . . . . . . . . . 92 3.20 Komponentenspektren der MCR-ALS-Auswertung einer BeF− 3 -Titration . 93 3.21 BeF− 3 -Differenzspektrum von membrangebundenem Ras . . . . . . . . . . 95 3.22 KD -Titration des membrangebundenen Ras mit BeF− 3 . . . . . . . . . . . 96 3.23 Aktivitätstest durch BeF− 3 -Titration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97 3.24 Nukleotidaustausch von membrangebundenem Ras . . . . . . . . . . . . . 103 3.25 Startwerte für die MCR-ALS Auswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106 3.26 Exinktionsprofil der MCR-ALS-Auswertung von vier Hydrolysemessungen 107 3.27 Hydrolysedifferenzspektrum von membrangebundenem Ras . . . . . . . . 108 3.28 Hydrolysedifferenzspektrum von membrangebundenem Ras inklusive des Wasserabsorptionsbereichs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109 3.29 Hydrolysekinetik von membrangebundenem Ras und Ras in Lösung . . . 110 3.30 Domänenaufbau von Nore1A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114 3.31 NoreRBD-Anbindung an membrangebundenes Ras . . . . . . . . . . . . . 117 3.32 Anbindung von NoreRBD verschiedener Konzentrationen an membrangebundenes Ras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119 3.33 Kinetische Auswertung der NoreRBD- . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120 3.34 Einfluss der Transferfunktion auf die NoreRBD-Anbindungskinetik . . . . 123

143

Tabellenverzeichnis 2.5

Messparameter der FTIR-Spektrometer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

2.6

Verwendete Extinktionskoeffizienten und Brechungsindices . . . . . . . . . 43

2.7

AmidI-Frequenzen der häufigsten Sekundärstrukturen . . . . . . . . . . . 47

3.1

Quantitative Informationen über die erzeugten SSLBs . . . . . . . . . . . 64

3.2

Infrarotabsorption von α-Helices . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

3.3

Sekundärstruktur von membrangebundenem Ras . . . . . . . . . . . . . . 87

3.4

Messablauf des Berylliumfluorid-Titrationen . . . . . . . . . . . . . . . . . 90

3.5

Ablauf des Nukleotidaustauschs und der Hydrolysemessung . . . . . . . . 101

3.6

Messablauf der Hydrolysemessung von N-Ras in Lösung . . . . . . . . . . 102

3.7

Messablauf der NoreRBD-Messung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116

3.8

Kinetische und thermodynamische Daten der Interaktion von NoreRDB mit membrangebundenem Ras

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121

144

Bereits veröffentlichte Teile der Arbeit Zeitschriftenbeiträge • Güldenhaupt, J., Adigüzel, Y., Kuhlmann, J., Waldmann, H., Kötting, C., and Gerwert, K. „Secondary structure of lipidated Ras bound to a lipid bilayer“ FEBS J, 2008, 275(23):5910–5918.

Posterbeiträge • Yekbun Adigüzel, Jörn Güldenhaupt, Carsten Kötting, Jürgen Kuhlmann, Herbert Waldmann, and Klaus Gerwert, „ATR-FTIR investigation of membrane bound ras protein“, III. Internationales Symposium des Sonderforschungsbereichs 642, November 2006, Bochum, Deutschland • Güldenhaupt, J., Adigüzel, Y., Kuhlmann, J., Waldmann, H., Kötting, C., and Gerwert, K. „Towards timeresolved ATR-FTIR spectroscopy of membrane bound Ras-Protein“, Membrane Interacting Peptides and Proteins, International Bunsen Discussion Meeting, März 2007, Halle(Saale), Deutschland • Güldenhaupt, J., Adigüzel, Y., Kuhlmann, J., Waldmann, H., Kötting, C., and Gerwert, K. „ATR-FTIR Spectroscopy of Ras Protein bound to solid supported lipid membranes“, German Biophysical Society Meeting 2008 - GBSM 2008, Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Biophysik, September 2008, Berlin, Deutschland

145

Lebenslauf Persönliche Informationen Geburtsdatum:

07.10.1977

Geburtsort:

Werne

Familienstand:

ledig

Nationalität:

deutsch

Eltern:

Klaus Güldenhaupt, Christel Güldenhaupt geb. Feldmann

Adresse:

Von-Einem-Str. 50, 45130 Essen

Ausbildung 1984–1988

Schiller Grundschule Bergkamen

1988–1997

Städtisches Gymnasium Kamen

1997–1998

Zivildienst, Biologische Station des Kreis Unna

1998–2005

Studium der Biologie, Ruhr-Universität Bochum Diplomarbeit am Lehrstuhl für Biophysik

2005–2006

Betreuungstätigkeit am Lehrstuhl für Biophysik

2006–2010

Promotion am Lehrstuhl für Biophysik

146

Erklärung Hiermit erkläre ich, dass ich die Arbeit selbständig verfasst und bei keiner anderen Fakultät eingereicht habe und dass ich keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel verwendet habe. Es handelt sich bei der heute von mir eingereichten Dissertation um sechs in Wort und Bild völlig übereinstimmende Exemplare. Weiterhin erkläre ich, dass digitale Abbildungen nur die originalen Daten enthalten und in keinem Fall inhaltsverändernde Bildbearbeitung vorgenommen wurde.

Bochum, den 15.04.2010