Abteilung Molekulare Genetik (B060)

Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung

Abteilung B060 Molekulare Genetik

Abteilung Molekulare Genetik (B060) Leiter: Prof. Dr. Peter Lichter Wissenschaftliche Mitarbeiter PD Dr. Stefan Joos Dr. Armin Pscherer Dr. Claudia Schaffner Dr .Stephan Wolf Dr. Meinhard Hahn (7/01-) Dr. Boris Zielinski (8/01) Dr. Daniel Mertens Dr. Björn Fritz (1/00-)

Dr. Antoaneta Mincheva Dr. Karsten Richter Dr. Solinas-Toldo Dr. Michelle Neßling Dr. Bernhard Radlwimmer (12/01-) Dr. Kai Neben (6/01-) Dr. Carsten Schwänen ( - 6/02)

Gastwissenschaftler Prof. Donald Olins (3- 5/02) Prof. Ada Olins (3-5/02) Dr. Peter Schraml (4-12/02) Prof. Dr.Andrey Korshunov (3-5/02 und 5-9/03)) Dr. Heiko Fensterer (10/02-3/03) Doktoranden Martyna Adamowicz (12/00-) Sabine Görisch (10/00 -) Christian Korz (3/00-11/03) Lars Hummerich (8/01-) Gunnar Wrobel (12/99-11/03) Cordula Tschuch (3/01-) Frank Mendrzyk (8/02-) Ute Schmidt (1/02-) Grischa Tödt (9/02-) Melanie Ruppel (7/03-) Julia Schliwka (3/03-) Jacek Mazurkiewicz (4/03-)

Carsten Sticht(4/02-) Felix Kokocinski (5/00-) Ilka Prowatke ((5/01) Markus Scheuermann (5/00 -) Jörg Schlingemann (11/01-) Otto Mannherz (6/01-) Hendrik Reuter (8/02-) Björn Tews (6/02-) Olaf Thürigen (9/02-) Leticia Serra Barrionuevo (1/03-) Katalin Fejes Toth (5/01-)

Technische Mitarbeiter Heidi Kramer Sibylle Ohl Tajana Salvi Andrea Wittmann Elke Grünewald Andrea Nijakowski Laura Puccio (1/03-)

Frauke Devens Magdalena Schlotter Kathrin Wildenberger Petra Schröter Stefanie Hofmann Daniela Bodemer

Diplomanden Julia Schliwka (8/02-2/03)

Melanie Ruppel (10/02-6/03)

Ingenieur Daniel Göttel (10/98-) Sekretariat Margit Michaeli-MacLeod (5/99-)

Molekulargenetische und zytogenetische Analysen menschlicher Tumoren Die Ziele unserer molekularen und zytogenetischen Analyse humaner Tumoren sind: 1. die Klärung des Pathomechanismus einzelner Tumoren durch die Identifizierung der beteiligten Tumorsuppressorgene und Onkogene und der übergeordneten biochemischen Signal- oder Kontrollsysteme; 2. die Identifizierung genetischer Aberrationen bzw. molekularer Signaturen, welche von prognostischer Relevanz sind und zur Stratifizierung der Tumor-Patienten für geeignete Therapieschemata beitragen.

Hämatologische Erkrankungen P. Lichter In Zusammenarbeit mit Hartmut Döhner, Martin Bentz, Stefan Stilgenbauer (Innnere Medizin III, Universität Ulm), Peter Möller, und Thomas Barth (Pathologisches Institut der Universität Ulm), Jörg Kalla and H.K. Müller-Hermelink (Pathologisches Institut der Universität Würzburg), Rainer Siebert (Humangenetisches Institut der Universität Kiel), Anna Jauch (Humangenetisches Institut der Universität Heidelberg) und Alfred Nordheim (Zellbiologisches Institut der Universität Tübingen).

Ein Schwerpunkt unserer Arbeiten bezieht sich auf die NonHodgkin Lymphome chronisch lymphatische Leukämie vom B-Zell Typ (B-CLL) und Mantel-Zell Lymphom (MCL) (In Zusammenarbeit mit der Gruppe um Prof. H. Döhner, Ulm). Durch Fluoreszenz in-situ Hybridisierungs (FISH)-Studien waren die bei B-CLL häufigsten chromosomalen Aberrationen (Deletion von 13q, 11q, 17p, 6q und Trisomie 12) identifiziert und deren Korrelation zur Überlebenszeit der betroffenen B-CLL Patienten gezeigt worden [1]. Hypermutierte V(H)-Regionen, die einen bestimmten Reifungsgrad von B-Zellen innerhalb des Keinzentrums von Lymphknoten markieren, sind ebenfalls eng assoziiert mit längeren Überlebenszeiten [2, 3]. Sogenannte genomische „Hoch-Risiko“ Mutationen wie der Verlust von Chromosom 17p- oder 11q- zeigen sich vorwiegend in der V(H)-unmutierten Subgruppe, wohingegen „günstige“ Mutationen wie 13q-Verlust in der V(H)-mutierten Subgruppe mehr oder weniger gleich verteilt sind. Die Analyse des V(H)-Mutationsstatus und der VDJ-Umlagerung im MCL ergab eine Korrelation zwischen dem Auftreten somatischer Mutationen und der Expression bestimmter variabler Regionen [4]. Schließlich konnte in MCL-Proben eine Assoziation von mutierten V(H)-Ketten und einer höheren Rate von Komplett-Remissionen beobachtet werden. Der Verlust von Chromosom 13q stellt die häufigste genomische Veränderung in beiden Tumorentitäten B-CLL und MCL dar (> 50%) und betrifft immer eine Region, die die Gene RFPZ, BCMS (B-cell neoplasia-associated gene with multiple splicing) und BCMSUN enthält. BCMS besitzt viele Splice-Varianten, welche mit Hilfe von Mutations- und Expressions-Analysen analysiert wurden [5]. Für die relevanten Gene konnten keine mutierten Gen-Transkripte, jedoch unterschiedliche Expressionsspiegel gefunden werden, die allerdings nicht durch epigenetische Phenomene wie einem veränderten DNA-Methylierungsmuster zustande kommen [6]. Unsere Genexpressions-Analysen innerhalb von B-CLL und MCL wurden mit Hilfe der quantitativen „real-time PCR“ Technik auf tumor-assoziierte Kandidatengene und Proliferations- und Apoptose-assoziierte Gene ausgeweitet [7]. Von den signifikant unterschiedliche exprimierten Genen erlauben die Gene Cyclin D1, CDK4, und c-myc eine eindeutige Klassifizierung von B-CLL und MCL. Der verschiedenartige Pathomechnismus der beiden Lymphomentitäten wird auch durch das Gesamtergebnis der Expressionsanalyse von 17 Genen in 62 B-CLL- und 16 MCL-Proben belegt. Hier zeigte sich, dass das Expressionsgleichgewicht dieser Gene in B-CLL in Richtung Schutz vor Apoptose in den malignen Zellen verschoben ist, wohin-

DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003

129

Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung gegen in MCL eine Stärkung in Richtung Proliferation aufgezeigt werden konnte.

130

Bezogen auf die malignen Lymphome konzentrierten wir uns primär auf die mediastinalen B-Zell Lymphome (MBL) [9-10] und das Hodgkin-Lymphom (HD) [11-14]. Beim Hodgkin-Lymphom liegen die malignen Zellen (die sogenannten Hodgkin- und Reed Sternberg (HRS) Zellen nur in einer Häufigkeit von etwa 1-2 % der Gesamtzellpopulation vor. Aus diesem Grunde müssen HRS Zellen für Untersuchungen durch Mikromanipulation isoliert werden. Eine Serie von 40 Hodgkin-Lymphomen wurde nach Mikrodissektion von HRS-Zellen und anschließender universeller Amplifikation der genomischen DNA mittels der vergleichenden genomischen Hybridisierung (CGH) analysiert. Die Studie ergab, dass HRS-Zellen durch häufig auftretende Zugewinne des kurzen Arms von Chromosom 2 und 9 charakterisiert sind. Weitergehende Analysen deuteten darauf hin, dass das c-REL Onkogen und das für eine Thyrosinkinase kodierende Gen JAK-2 diejenigen Gene sind, die über diese numerischen Veränderungen zur Entwicklung des malignen Phänotyps beitragen. Interessanterweise wurden ähnliche chromosomale Veränderungen in MBL und HD nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass sich die Pathomechanismen für beide Tumorentitäten zumindest teilweise überlappen.

Solide Tumoren In Zusammenarbeit mit Gabriele Schackert und Ramon Martinez (Klinik und Poliklinik für Neurochirurgie, Universität Dresden), Martin Zörnig (Chemotherapeutisches Forschungsinstitut, GeorgSpeyer-Haus, Frankfurt). Guido Sauter (Pathologisches Institut der Universität Basel, Schweiz), Andrey Korshunov (Burdenko Institut, Moskau, Russland)

Um weitere Einblicke in die molekularen Mechanismen bei Weichteiltumoren zu erhalten, analysierten wir über 200 Leiomyosarkome, maligne periphere Nervenscheidentumoren, gastrointestinale Strumatumoren sowie verschiedene Subtypen von Liposarkomen auf zytogenetische Veränderungen hin (in Zusammenarbeit mit G. Mechtersheimer, Pathologisches Institut Heidelberg) [15]. Eine CGH Studie von 19 dedifferenzierten und pleomorphen Liposarkomen zeigte gemeinsame sowie Subtyp-spezifische chromosomale Veränderungen [16]. So wiesen pleomorphe Liposarkome vor allem Zugewinne der chromosomalen Regionen 5p13p15, 1p21, 1q21-q22 und 7q22 auf, während dedifferenzierte Tumoren vor allem durch hochgradige Amplifikationen auf dem langen Arm von Chromosom 12 charakterisiert waren. Chromosomale Imbalancen in Liposarkomen wurden weiter durch die hochauflösende Matrix CGH (s.u.) untersucht. Eine Anzahl von Genen konnte identifiziert werden, die bisher nicht mit der Entwicklung dieser Tumoren in Verbindung gebracht wurden, wie zum Beispiel ISR1 und AIB1 . Durch die erhaltenen Daten konnten beide Tumorsubtypen durch geeignete Clusteranalysen klar voneinander getrennt werden. Darüber hinaus wurden mehrere Klone, die zwischen den verschiedenen Subtypen unterscheiden können, durch das support vector machine Verfahren identifiziert [17]. Wir haben uns darüber hinaus auf genetische Veränderungen in Plattenepithelkarzinomen der Kopf-Hals-Region (HNSCCs) konzentriert. CGH Analysen von 20 Tumoren zeigten hochgradige Amplifikationen und Zugewinne des distalen Teils von Chromosom 3q. Um die kleinste überlappende Region dieser Amplifikationen zu bestimmen, wur-

Abteilung B060 Molekulare Genetik den mehrere dieser HNSCCs mit der hochauflösenden Matrix CGH (s.u.) analysiert. Hierfür wurde ein Chromosom 3q26q28 spezifischer DNA-Chip mit 20 BAC Klonen eingesetzt. Eine gemeinsam in allen untersuchten Fällen amplifizierte Region konnte auf 3 Megabasen eingegrenzt werden. Derzeit werden verschiedene Transkripte innerhalb dieser Region auf ihre pathogenetische Rolle in diesen Tumoren hin untersucht. HNSCCs wurden außerdem mittels des sogenannten Gewebearray (TMA)-Verfahrens analysiert (s.u.). Wir konstruierten ein TMA von etwa 600 HNSCCs und untersuchten die Frequenz hochgradiger Amplifikation von verschiedenen Onkogenen. Es wurden Korrelationen zwischen Genamplifikationen und der Lokalisation der Tumoren gefunden, was darauf hindeutet, dass diese Tumortypen durch unterschiedliche molekulare Aberrationsmuster charakterisiert sind. Hinsichtlich die Überlebensrate der Patienten erwies sich keines der getesteten Gene als signifikanter klinischer prognostischer Marker. [18-20]. Ein weiterer Schwerpunkt unserer Arbeitsgruppe bezieht sich auf molekular-zytogenetische Untersuchungen maligner Tumoren des zentralen Nevensystems. So wurden chromosomale Imbalancen in metachronen Glioblastomen sowie in Zusammenhang mit dem Ansprechen auf Chemotherapie und zytotoxischen Zytokinen in malignen Gliomen mittels CGH untersucht [21, 22]. In letzteren Fällen waren am häufigsten die Chromosomen 1, 7q, 19q und 20q von numerischen Zugewinnen betroffen, während die Chromosomen 4q, 11q, 13q, und 18q und oft unterrepräsentiert waren. In Zusammenarbeit mit Guido Reifenberger (Düsseldorf) und Ruthild Weber (Bonn) wurde darüber hinaus der Mutationsstatus von potentiellen Kandidatengenen analysiert, die innerhalb der deletierten Loci in Meningiomen lokalisiert sind. Bezüglich der Kandidatengene auf dem chromosomalen Arm 9p zeigten unsere Ergebnisse, dass das CDKN2C Gen selten in Meningiomen verändert ist. Die Mehrzahl der anaplastischen Meningiome zeigte jedoch entweder homozygote Deletionen von CDKN2A, p14 (ARF) und CDKN2B oder Mutationen bzw. einen Expressionsverlust in CDKN2A und p14 ARF. Das weist darauf hin, dass die Inaktivierung des G1/S Checkpoints im Zellzyklus anaplastischer Meningiomzellen eine wichtige pathogenetische Veränderung darstellt. Bezüglich der Kandidatengene auf Chromosom 18q (MADH2, MADH4, APM1 und DCC) fanden sich keine Hinweise auf Veränderungen in diesen Tumoren. Genomische Analysen solider Tumoren wurden außerdem bei Gliosarkomen [23], Mamakarzinomen [24], Melanomen [25] und Pankreaskarzinomen [26] durchgeführt. Weitere Gene (z.B. VPS7 und NF1), die in Zusammenhang mit der Entstehung verschiedener Tumoren stehen, wurden eingehend mittels FISH analysiert [27, 28]. Basierend auf eigenen veröffentlichten Daten wurde eine CGH Datenbank etabliert, welche molekular-zytogenetische Informationen über etwa 3000 unterschiedliche Tumoren enthält (etwa 700 hämatologische Erkrankungen, 500 Karzinome, 250 Weichteiltumoren und 350 ZNS Tumoren) [29]. Mit Hilfe dieser Datenbank zeigte sich, dass hochgradige Amplifikationen des distalen kurzen Arms von Chromosom 5 in 10% aller Tumoren auftraten. Da diese Veränderung besonders unter den Liposarkomen sehr häufig auftritt (18%), haben wir damit begonnen, die Amplifikationen in diesen Tumoren mittels der Matrix-CGH näher zu bestimmen.

DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003

Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung Profiling Chromosomaler Abberationen mittels Matrix-CGH Ein auf DNA-Mikroarrays basierender Ansatz der vergleichenden genomischen Hybridisierung (Matrix-CGH) wurde von unserem Labor zum ersten mal 1997 vorgestellt (SolinasToldo et al. 1997). Dabei werden die Metaphasen-Chromosomen durch geordnete, auf einer Glasoberfläche immobilisierte DANN-Fragmente ersetzt, sodass im Vergleich zur konventionellen CGH neben einer höheren Auflösung auch eine Grundlage für die automatisierte Analyse genomischer Imbalancen möglich ist. Mit einer vergleichenden genomischen Hybridisierung gegen eine solche Matrix aus DANNProben (wie z.B. Cosmide, PACs oder BACs) werden aus dem Verhältnis der Fluoreszenzsignale von Test- und Kontroll-DNA Zugewinne oder Verluste an genetischem Material mit einer Auflösung von bis zu ca. 50 kb nachgewiesen. Im Rahmen der methodischen Optimierung des Matrix-CGH Verfahrens wurde das experimentelle Protokoll weiter verbessert, neue Analyseprogramme entwickelt, und die Datenauswertung zentralisiert [30]. Anwendungen bei verschiedenen NHL zeigten, dass mit diesem Ansatz eine Vielzahl versteckter Amplifikationen gefunden wurden [3133]. Darüber hinaus wurde ein neuer Matrix-CGH Chip entwickelt zur genomweiten Analyse von chromosomalen Abberationen entwickelt. Dieser Chip, bestehend aus ca. 6000 genomischen Fragmenten, erlaubt Kopienzahl-Screening mit einer Auflösung von 1 Megabase oder besser, bei gleichzeitiger Analyse von etwa 1800 potentiell Tumorphatogeneserelevanten Genen. Im Rahmen des Nationalen Genomforschungsnetzes (NGFN) bestehen mit verschiedenen Kliniken und Forschungseinrichtungen Kooperationen, wobei das Verfahren der Matrix-CGH gezielt für die Bearbeitung definierter Fragestellungen eingesetzt wird [31-36]. Für die jeweilige fokussierte Anwendung wurden spezifische DNA-Mikroarrays von uns hergestellt und analysiert: •

Krankheitsspezifische DNA-Chips, die schnelle und parallele Analyse der prognostisch relevanten Veränderungen der B-CLL und M-CLL ermöglichen. Diese in Zusammenarbeit mit Prof. Döhner (Universität Ulm) entwickelten Chips wurden in Studien der respektiven Tumorentitäten eingesetzt. In einer „Blindstudie“ von 106 Patienten zeigte der B-CLL Chip eine Sensitivität von 100% im Vergleich zu einer bereits vorliegenden FISH Daten [36]. In eine Analyse von MCL Patientenproben konnten mehrere rekurrent abberante chromosomale Regionen genauer eingegrenzt werden [32].

•

Zur Eingrenzung pathogenetisch relevanter Kandidatenregionen und Identifizierung der von Deletionen bzw. Amplifikationen betroffenen Gene werden Chips eingesetzt, die benachbarte, überlappende chromosomale Fragmente enthalten. Experimentelle Analysen zur Feinkartierung von Abberationen auf Chromosom 12 in B-CLL, Chromosom 1 (Retinoblastoma), Chromosom 4 (Ovarialkarzinom), und Chromosom 5 (Weichteilsarkome) wurden abgeschlossen.

•

Der neuentwickelte Matrtix-CGH Chip zum genomweiten Screening wird zur Zeit zur Untersuchung von Medulloblastomen, Ependymomen, Invasiven Mammakarzinomen, Akuter Myeloischer Leukämie und Hodgkin Lymphomen eingesetzt.

Abteilung B060 Molekulare Genetik

Expression Profiling durch DNA-Microarrays In Zusammenarbeit mit Peter Angel, Jochen Hess, Oliver Pein, Regina Müller und Lore Florin (A100, DKFZ), Roland Eils (B080, DKFZ), Lutz Edler und Axel Benner (C060, DKFZ), Hartmut Goldschmidt und Friedrich Cremer (Innere Medizin V, RuprechtKarls-Universität Heidelberg), Christof Hofele und Kolja Freier (Klinik und Poliklinik für Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie, Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg), Andreas Schneeweiß, Christian Rudlowski und Gunther Bastert (Frauenklinik, RuprechtKarls-Universität Heidelberg), Martin Zeier und Christian Morath (Medizinische Universitätsklinik, Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg), Alwin Krämer (Medizinische Poliklinik, Universität Heidelberg), Hartmut Döhner, Peter Liebisch, Martin Bentz, Stephan Stilgenbauer und Thomas Gress (Innere Medizin, Universität Ulm), Brigitte Schlegelberger (Zelluläre und Molekulare Pathologie, Medizinische Hochschule Hannover), Bernd Groner, Roland Stauber, Sylvane Desrivieres und Edith Pfitzner (GeorgSpeyer-Haus, Frankfurt/Main), Guido Reifenberger (Neuropathologie, Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf), Andreas von Deimling und Christian Hartmann (Neuropathologie, Charité Berlin), Ramon Martinez (Universität Dresden), Claudia Schoch (Medizinische Klinik und Polyklinik III, Ludwig-Maximilians-Universität, München), Alfred Nordheim (Zellbiologie, Eberhard-KarlsUniversität Tübingen), Stefan Bohlander und Christian Buske (GSF, München), Georg Zoidl und Cantas Alev (Ruhr-Universität Bochum), Ludger Fink, Jochen Wilhelm und Katja BeckerBrandenburg (Justus-Liebig-Universität Gießen), Lilly Deutschland GmbH (Bad Homburg), Carl Zeiss Jena GmbH (Jena), BioRad Laboratories GmbH (München), Andrey Korshunov und Andrey Golanov (Neuropathologie, Neurochirurgisches N.-N.-BurdenkoInstitut, Moskau, Rußland), Ulf Landegren (Genetik und Pathologie, Rudbeck Laboratorium, Uppsala, Schweden), Ada & Don Olins (Scarborough, Maine, USA), Uta Lichter-Konecki (NIH, USA), Alan Harris (The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, Melbourne, Australien).

In unserer Gruppe sind wir vorrangig daran interessiert, umfassende Genexpressionsprofile menschlicher Tumoren zu analysieren. Hierdurch sollen wichtige Erkenntnisse gewonnen werden, z.B. über die Aktion/Regulation von Genen unbekannter Funktion oder über krankheitsspezifische zelluläre Regulationswege (“pathways”). Für die Bearbeitung dieser Fragestellung setzen wir in unserem Labor die DNAMicroarray-Technik ein. Hierzu werden auf einer Glasoberfläche PCR-amplifizierte, genspezifische cDNA-Fragmente oder chemisch synthetisierte genspezifische 70mer Oligonukleotide immobilisiert, mit denen anschließend die aus der Tumorprobe isolierten Transkripte in Form Fluorophor markierter cDNA analysiert werden [37]. So haben wir u.a. einen “OncoChip” mit ca. 5000 verschiedenen genspezifischen Sonden entwickelt, welcher für 2600 Gene mit bekannter onkologisch / hämatologischer Bedeutung (u.a. involviert in Zellzyklus, Apoptose-Induktion, Erythropoese, Mitose) spezifisch ist. Hierüber können umfassende Expressionsprofile krebsrelevanter Gene erstellt werden. Dieser Microarray wird u.a. zur Profilierung von hämatologischen Neoplasien [38] und Liposarkomen [17, 39], insbesondere aber auch von Tumoren des zentralen Nervensystems (z.B. Ependymome [40], Meningiome, Medulloblastome [41], Oligodendrogliome) genutzt. So konnten an der promyeloischen Zelllinie HL-60, die sich bei Stimulus mit TPA oder Retinsäure unterschiedlich differenziert, wichtige Erkenntnisse zur Regulation dieses Differenzierungsgeschehens gewonnen werden [Wrobel, Dissertation 2004]. Diese Studien werden ergänzt und verifiziert durch quantitative real-time-PCR-Versuchsreihen (siehe z.B. [40]). Im Berichtszeitraum wurden Sammlungen von genspezifischen Sonden für die Forschung zugänglich, die mehrere

DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003

131

Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung zehntausend Gene und somit weite Bereiche der Gene des menschlichen und murinen Genoms umfassend repräsentieren. Um hiervon entsprechende DNA-Microarrays herstellen zu können, mussten die etablierten bisherigen Protokolle weiterentwickelt werden. Durch umfassende methodische Optimierungsarbeiten, die u.a. die Art der verwendeten Glasoberfläche, Spotting-Pufferrezeptur, Minimierung der Hintergrund-Fluoreszenz und erzielbare SpotDichte umfassten, konnte ein Protokoll entwickelt werden, welches die Aufbringung von bis zu 70.000 genspezifischen Sonden auf einer Glasoberfläche ermöglicht [37].

132

Ein weiteres gravierendes Problem bei der Analyse von Tumortranskriptomen besteht in der oftmals limitierten Menge an RNA-Ausgangsmaterial, die die Analyse stark beeinträchtigt oder gar verhindert. Deshalb haben wir ein neuartiges in-vitro-mRNA-Amplifikationsprotokoll entwickelt, welches es gestattet, selbst von geringen NanogrammMengen Gesamt-RNA ausgehend, ausreichend aRNA zu generieren, um hiermit zuverlässig und erfolgreich Expression-Profiling-Experimente auf Oligonukleotid-Microarrays durchführen zu können. Bisherige RNA-Amplifikationsprotokolle waren mit gespotteten OligonukleotidMicroarrays, die üblicherweise sense -orientierte Oligonukleotid-Sonden tragen, nicht kompatibel, da diese Verfahren ebenfalls einen markierten sense-cDNA-Strang produzieren. Dies neuartige Protokoll ergibt Dye-markierte antisense-cDNA, die mit den üblichen Typen gespotteter Oligonukleotid-Microarrays voll kompatibel ist, so dass diese Amplifikationstechnik einen wichtigen technologischen Fortschritt auf diesem Gebiet darstellt. Das Verfahren wurde seitdem in einer Vielzahl von Projekten sehr erfolgreich angewendet. Einen methodisch äußerst wichtigen Aspekt im Zusammenhang mit Microarray-Experimenten stellt die finale Analyse und Interpretation der gewonnen enormen Datenmengen dar. Die Datenanalyse erfolgt über komplexe Computerverfahren, die unterschiedliche Methoden der Bioinformatik, Biostatistik und des Data Mining vereinen. Benötigt werden des Weiteren spezifische Datenbanken, die alle grundlegenden Informationen zu den auf die Microarrays aufgebrachten genspezifischen Sonden (z.B. Klon- und Geninformationen) erfassen und speichern. Dies erfolgt in unserer selbst entwickelten “clone database”, die u.a. Links zu den bedeutenden biologischen Datenbanken, Informationen über Genlokalisation, funktionelle Annotation etc. umfasst und sich automatisch selbst aktualisiert. Alle relevanten Schritte der high-throughput-Experimente sowie des Microarray-Produktionsprozesses werden zudem in unserem selbst entwickelten Laboratory Information and Management System “QuickLIMS” [42] erfasst und dokumentiert. Als Kernkomponente der Datenspeicherung und der statistischen Analyse der Microarray-Experimente, entsprechend der MIAME-Standards, wurde ferner das Programmpaket “ChipYard framework” entwickelt, welches es dem Microarray-Anwender ermöglichen soll, seine experimentellen Ergebnisse unter definierten Bedingungen auswerten zu können. Die beschriebenen methodischen Entwicklungen waren die Voraussetzung für die erfolgreiche Herstellung und Anwendung eines neuen Microarray-Typs, der für 27.000 humane Gene spezifische 70mer Oligonukleotide jeweils als Replikat trägt (d.h. insgesamt 54.000 Spots je Microarray). Dieser 70mer-Microarry wurde im Rahmen verschiedener Studien an epithelialen, hämatologischen und cranialen Tumorserien

Abteilung B060 Molekulare Genetik sowie Zellkultur-Modellen von Apoptose bis Organabstoßung mit großem Erfolg eingesetzt, so u.a.: •

Basaliome: Expression-Profiling-Studien an einer Serie von Basaliomen und nachfolgende bioinformatische Analysen der identifizierten, im Vergleich zu normaler Haut differentiell exprimierten Gene zeigten, dass in diesen Tumoren insbesondere Gene des Zellzyklus, der Meiose und von DNA-Replikation/ Chromosomal Cycling hochreguliert sind. Durch Vergleich mit Daten aus Expression-Profiling-Studien am Tumorprogressionsmodell der murinen Haut nach DMBA/TPA-Behandlung wurden wichtige gemeinsame Kandidatengene und Pathways identifiziert, die für die humane epidermale Karzinogenese relevant sind und derzeit molekular eingehend weiter charakterisiert werden [43].

•

Studien zur molekularen Wirkung eines neuartigen Immunsuppressivums und Proliferationshemmers im Zellkulturversuch.

•

Studien an primären Mammatumoren zur Identifizierung prognostisch relevanter Gensignaturen.

Weiterhin wurden zwei umfassende DNA-Microarray-Typen für die Analyse muriner Expressionsprofile hergestellt, die 20.000 (LION-Microarray) bzw. 23.000 (NIA-Microarray) verschiedene genspezifische Sequenzen der Maus repräsentieren. Hierdurch kann nun auch das für die Tumorforschung äußerst wichtige Tiermodell “Maus” mittels dieser Technik erschlossen werden. In einer in Zusammenarbeit mit der Abteilung von P. Angel durchgeführten Studie zur Tumorprogression konnten zahlreiche Gene identifiziert werden, die in der Maus an der mehrstufigen Entstehung von Hauttumoren unter Einfluss des Tumorpromoters TPA beteiligt sind. Diese Ergebnisse wurden durch quantitative real-timePCR bestätigt. Erste auf diesen Ergebnissen basierende Folgestudien an humanen Tumoren belegen bereits, dass einige der so identifizierten Gene auch an der Entstehung menschlicher Hauttumoren beteiligt sind.

Gewebe Mikroarrays In Zusammenarbeit mit Harald Stein (Benjamin-Franklin-Hospital, Berlin), Bernd Dörken (Charite, Berlin), Guido Sauter (Pathologisches Institut der Universität Basel), Andrey Korshunov (Burdenko Institut, Moskau), Hermann-Joseph Gröne (DKFZ)

Gewebe Mikroarrays (DNAs) sind geeignet für Hochdurchsatzuntersuchungen immunhistochemischer und zytogenetischer Parameter von klinisch definiertem Tumormaterial. Kandidatengene und Proteine können mit Hilfe von TMAs schnell auf Zusammenhänge mit klinischen Parametern wie der Bildung von Metastasen oder dem Gesamtüberleben hin getestet werden. Wir haben TMAs aus mehr als 5500 verschiedenen Tumoren von 2700 unterschiedlichen Patienten hergestellt. Darin sind enthalten: Tumoren der KopfHals-Region, Prostatakarzinome, Basaliome, Hodgkin Lymphome, niedrig und hochmaligne B-Zell Lymphome, T-Zell Lymphome, Meningiome, Medulloblastome, Thymome sowie adenoid-zystische Karzinome. Die Protokolle für die Fluoreszenz in situ Hybridisierung an TMAs wurden weiter optimiert, sodass Untersuchungen auf TMAs mit BAC und PAC Sonden jeder beliebigen genomischen Region durchgeführt werden können [19]. Darüber hinaus führten wir eine neue Strategie zur automatischen Daten-Aufnahme und Evaluation immunhistochemischer Analysen ein. Diese basiert auf der Erfassung digitaler Bilder mittels Laser Scanninng Verfahren [26]. Beide der genannten Applikationen sind von hohem praktischen Wert und wurden für eine Anzahl von

DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003

Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung Studien, die im besonderen Genom- und Expressionsprofilstudien ergänzten, eingesetzt [20, 39-41]. Funktionelle Architektur des Interphase-Zellkerns Interphase-Chromosomen sind territorial organisiert, wobei Gene vor allem in der Peripherie dieser Territorien liegen (Kurz et al. 1996) während die sog. nuclear bodies typischerweise außerhalb von Chromosomen-Territorien gefunden werden. Das sogenannte ICD-Modell (ICD: Interchromosomal Domain) postuliert darüber hinaus, dass zwischen den Chromosomen-Territorien ein funktionelles nukleares Kompartiment existiert, welches mit der Transkription zusammenhängt (Zirbel et al. 1993). Zur Charakterisierung der strukturellen und funktionellen Organisation des Interphase-Zellkerns (siehe auch [8]) untersuchen wir in diesem Zusammenhang die Lokalization genomischer Sequenzen relativ zur Ausdehnung des zugehörigen Chromosoms durch Fluorescence in-situ hybridiszation (FISH), die Verteilung und Dynamik endogener wie exogener Substanzen bzw. Partikel durch 3-dimensionale, zeitaufgelöste Laser-Scanning Mikroskopie, sowie die Diffusionswege exportkompetenter RNA. Neuere FISH-Untersuchungen mit Proben zu transkriptionell aktiven Regionen im Vergleich zu Regionen ohne bekannte Funktionalität zeigen, dass die inaktiven Regionen hauptsächlich an der Kernperipherie lokalisiert sind, während transkriptions-aktive Regionen eher zum Innern des Zellkerns hin lokalisiert sind. Mit der Vorstellung, dass das Chromatin durch seine Struktur diffusionsabhängige Prozesse hemmt, wäre es also denkbar, dass Chromosomenterritorien kernperipher dichter gepackt sind als im Kerninnern. Bezogen auf den ICD wäre dann zu erwarten, dass der interchromosomale Raum nahe der Kernperipherie enger und schärfer begrenzt ist, der ICD sich in Richtung Zentrum des Kerns dagegen lakunenartig aufweitet und sich der Übergang zu den angrenzenden Chromosomenterritorien zunehmend verwischt. Zur Darstellung dieses funktionell aktiven, diffusionskompetenten Raumes arbeiten wir aktuell an einer Methode, selektiv die exportaktive, endogene RNA zu markieren. Mikroinjizierte Dextrane verteilen sich sehr schnell im Zellkern. Injektion fluoreszenzmarkierter Dextrane unterschiedlicher molekularer Grösse hat gezeigt, dass die Verteilung mit zunehmender Größe inhomogener wird [44]. Für größere, partikuläre Molekülaggregate, z.B. die endogenen nuclear bodies, war schon in der Vergangenheit gezeigt worden, dass sie nicht in Chromosomenterritorien eingebettet liegen (Zirbel et al. 1993). Im Besonderen gilt das auch für exogen exprimiertes Xenopus vimentin (in collaboration with H. Herrmann, DKFZ). Vimentin gehört zu den zytoplasmatischen Intermediärfilamenten. Die Variante aus dem Krallenfrosch lässt sich temperaturabhängig reversibel polymerisieren: Temperaturen unter 30°C induzieren die Bildung von Vimentinbündeln im Kern von Zellen, die mit NLS-Vimentin transfiziert wurden. Diese Bündel folgen den Oberflächen von Chromosomenterritorien, sie dringen nicht in die Territorien ein Kolokalisation mit Markern für nuclear bodies wir z.B. speckles, PML-bodies oder Cajal bodies zeigen diese bodies häufig in unmittelbarer Nähe zu den Vimentin-Bündeln. Diese räumliche Nähe ist nicht durch eine Affinität der Vimentin-Filamente mit den Proteinbodies erklärbar, da einerseits Lebendbeobachtungen zeigen, dass sich beide Komponenten über die Zeit voneinander trennen können, anderseits zeigen elektronenmikroskopische Untersuchungen, dass sich die

Abteilung B060 Molekulare Genetik Komponenten nicht miteinander verbinden. Vielmehr erklärt sich die räumliche Nähe besser durch die Begrenzung des zur Verfügung stehenden Raumes: Die partikulären Kernbestandteile, die nicht in die Chromosomenterritorien vordringen können, müssen sich zwischen den Territorien aufhalten und werden dort zusammengedrängt. Ihre Mobilität ist dann mitbestimmt durch die Dynamik der Formveränderungen der Territorien. Messungen zur Dynamik von PML-bodies, Cajal-bodies und ektopisch exprimierten, kleinen Protein-Kristallen (YFP-Mx1) legen nahe, dass die Beweglichkeit dieser Partikel durch zwei Diffusionskonstanten bestimmt ist, die sich in einem Modell für ‘coralled diffusion’ als Zusammenspiel von der Eigendiffusion des Partikels im Nucleoplasma und der ‘Diffusion’ des zeitlich veränderlichen Raumes zwischen den Chromosomenterritorien verstehen lassen. Publikationen (* = externer Koautor) [1] *Döhner, H., *Stilgenbauer, S., Lichter, P. (2001) Chromosomal abnormalities in chronic lymphocytic leukemia. New Engl. J. Med. 344, 1254 [2] *Kröber, A., *Seiler. T., *Benner, A., *Bullinger, L., *Bruckle, E., Lichter, P., *Döhner, H., *Stilgenbauer, S. (2002) V(H) mutation status, CD38 expression level, genomic aberrations, and survival in chronic lymphocytic leukaemia Blood 100, 1410-1416 [3] *Stilgenbauer, S., *Bullinger, L., Lichter, P., *Döhner, H. (2002) Genetics of chronic lymphocytic leukemia: genomic aberrations and V(H) gene mutation status in pathogenesis and clinical course. Leukemia 16, 993-1007 [4] *Kienle, D., *Kröber, A., *Katzenberger, T,, *Ott, G., *Leupolt, E., *Barth, T.F., *Möller, P., *Benner, A., *Habermann, A., *Müller-Hermelink, H.K., *Bentz, M., Lichter, P., *Döhner, H., *Stilgenbauer, S. (2003) VH mutation status and VDJ rearrangement structure in mantle cell lymphoma: correlation with genomic aberrations, clinical characteristics, and outcome. Blood 102, 3003-3009 [5] Wolf, S., Mertens, D., Schaffner, C., Korz, C., *Döhner, H., *Stilgenbauer, S., Lichter, P. (2001) B-cell neoplasia associated gene with multiple splicing (BCMS): the candidate B-CLL gene on 13q14 comprises more than 560 kb covering all critical regions. Hum. Mol. Genet. 10, 1275-1285 [6] Mertens, D., Wolf, S., Schroeter, P., Schaffner, C., *Döhner, H., *Stilgenbauer, S., Lichter, P. (2002) Down-regulation of candidate tumor suppressor genes within chromosome band 13q14.3 is independent of the DNA methylation pattern in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood 99, 4116-4121 [7] Korz, C., Pscherer, A., *Benner, A., Mertens, D., Schaffner, C., *Leupolt, E., *Döhner, H., *Stilgenbauer, S., Lichter, P. (2002) Evidence for distinct pathomechanisms in B-cell chronic lymphocytic leukemia and mantle cell lymphoma by quantitative expression analysis of cell cycle and apoptosis-associated genes. Blood 99, 4554-4561 [8] Rätsch, A., Joos, S., Kioschis, P., Lichter. P. (2002) Topological organization of the MYC/IGK locus in Burkitt’s lymphoma cells assessed by nuclear halo preparations. Exp. Cell Res. 273, 12-20 [9] *Bentz, M., *Barth, T.F.E., *Brüderlein, S., Bock, D., *Schwerer, M.J., *Baudis, M., Joos, S., *Viardot, A., Lichter, P., *Döhner, H., *Möller, P. (2001) Gain of chromosome arm 9p is characteristic of primary mediastinal B-cell lymphoma - a comprehensive cytogenetic analysis and presentation of a novel MBL cell line. Genes Chromosom. Cancer 30, 393-401 [10] *Barth, T.F.E., *Leithäuser, F., Joos, S. und *Möller, P. (2001) Mediastinal (thymic) large B-cell lymphoma now canonised in the WHO classification of malignant lymphomas: where do we stand? The Lancet Oncology, 3, 229-234

DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003

133

Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung [11] Küpper, M., Joos, S., von *Bonin F., *Daus, H., *Pfreundschuh*, M., Lichter, P., *Trümper, L. (2001) MDM2 gene amplification and lack of p53 point mutations in Hodgkin and Reed-Sternberg cells: Results from single cell polymerase chain reaction and molecular cytogenetic studies. Br. J. Haematol. 112, 768-775 [12] Joos, S., *Menz, C.K., *Siebert, R., *Geske, S., Ohl, S., Wrobel, G., *Mechtersheimer, G., *Trümper, L., *Möller, P., Lichter, P., *Barth, T.F.E. (2002) Classical Hodgkin’s lymphoma is characterized by recurrent copy number gains of the short arm of chromosome 2. Blood 99, 1381-1387

134

[13] Joos, S., *Granzow, M., *Holtgreve-Grez, H., *Siebert, R., *Harder, L., Martín-*Subero, J.I., *Wolf, J., Adamowicz, M., *Barth, T.F.E., Lichter, P., *Jauch, A. (2003) Hodgkin´s lymphoma cell lines are characterized by frequent aberrations on chromosome 2p and 9p including REL and JAK. Int. J. Cancer 103(4), 489-495 [14] *Barth, T.F.E., *Martin-Subero, J.I., Joos, S., *Menz, C.K., *Hasel, C., *Mechtersheimer, G., *Ernst, M.K., *Rice, N., *Parwaresch, R.M., Lichter, P., *Siebert, R.,*Möller, P. (2003) Gains of 2p involving the REL locus correlate with nuclear c-Rel protein accumulation in neoplastic cells of classical Hodgkin’s lymphoma. Blood 101(9), 3681-3686 [15] *Mechtersheimer G, *Lehnert T, *Penzel R, Joos S, *Egerer G, *Otto HF. (2003) Gastrointestinale Stromatumoren: Eine morphologisch und molekular eigenständige Tumorentität mit neuer therapeutischer Perspektive. Der Pathologe 24(3), 182191 [16] *Rieker, R., Joos, S., *Bartsch, C., *Willeke, F., *Schwarzbach, M., *Otano-Joos, M., Ohl, S., *Högel, J., *Lehnert, T., Lichter, P., *Otto, H.F., *Mechtersheimer, G. (2002) Distinct chromosomal imbalances in pleomorphic and high grade dedifferentiated liposarcomas. Int. J. Cancer 99, 68-73 [17] Fritz, B., Schubert, F., Wrobel, G., Schwaenen, C., *Wessendorf, S., Nessling, M., Korz, C., *Rieker, R, *Bentz, M., *Montgomery, K., *Kucherlapati, R., *Mechtersheimer, G., Eils, R., Joos, S., Lichter, P. (2002) Microarray based copy number and expression profiling in dedifferentiated and pleomorphic liposarcoma. Cancer Research 62, 2993-2998 [18] *Hofele, C., Joos, S., *Flechtenmacher, C., *Bosch, F.X., Lichter, P., *Mühling, J., Freier, K. (2002) [Opportunities and chances for tissue chip microarrays in head and neck surgery. A novel technique for the rapid evaluation of potentially novel biomarkers] Mund Kiefer Gesichtschir. 6, 394-401 [19] Freier, K., Joos, S., *Flechtenmacher, C., Devens, F., Benner, A., *Bosch, F.X., Lichter, P., *Hofele, C. (2003) Tissue microarray analysis reveals site-specific prevalence of onogene amplifications in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Res. 63 (6), 1179-1182 [20] Freier, K., *Bosch, F.X., *Flechtenmacher, C., Devens, F., Benner, A., Lichter, P., Joos, S., *Hofele, C. (2003) Distinct sitespecific oncoprotein overexpression in head and neck squamous cell carcinoma: A tissue microarray analysis. Anticancer Res. 23 (5A), 3971-3977 [21] *Martinez, R., *Schackert, H.K., *von Kannen, S., Lichter, P., Joos, S.,*Schackert, G. (2003) Independent molecular development of metachronous glioblastomas with long-term recurrence free time. Brain Pathol. 13 (4):598-607 [22] *Weber, R.G., *Rieger, J., *Naumann, U., Lichter, P., *Weller, M. (2001) Chromosomal imnbalances associated with response to chemotherapy and cytotoxic cytokines in human malignant glioma cell lines. Int. J. Cancer 91, 213-218 [23] Actor, B., *Cobbers, J.M.L., *Büschges, R., *Wolter, M., *Knobbe, C.B., Lichter, P., *Reifenberger, G., *Weber, R.G. (2002) Comprehensive analysis of genomic alterations in gliosarcoma and its two tissue components. Genes Chromosom. Cancer 34, 416-427 [24] *Brezniceanu, M.L., *Volp, K., *Bosse,S., *Solbach, C., Lichter, P., Joos, S., *Zörnig, M. (2003) HMGB1 inhibits cell death in yeast and mammalian cells and is abundantly expressed in human breast carcinoma. FASEB J. 17 (10), 1295-1297

Abteilung B060 Molekulare Genetik [25] Wittig, R., Nessling, M., Will, R.D., Mollenhauer, J., Salowsky, R., Münstermann, E., Schick, M., Helmbach, H., Gschwendt, B., Korn, B., Kioschis, P., Lichter, P., Schadendorf, D., Poustka, A., (2002) Candidate genes for cross-resitance against DNA damaging drugs. Cancer Research 62, 6698-6705 [26] *Wallrapp, C., *Hähnel, S., *Boeck, W., Soder, A., Mincheva, A., Lichter, P., *Leder, G., *Gansauge, F., *Sorio, C., *Scarpa, A., *Gress, T.M. (2001) Loss of the Y chromosome is a frequent chromosomal imbalance in pancreatic cancer and allows differentiation to chronic pancreatitis. Int. J. Cancer 91, 340-344 [27] *Beyer, A., *Scheuring, S., *Müller, S., Mincheva, A., Lichter, P., *Kohrer, K. (2003) Comparative sequence and expression analyses of four mammalian VPS4 genes. Gene 305, 4759 [28] *Gründer, A., *Qian, F., *Ebel, T.T., Mincheva, A., Lichter, P., *Kruse, U., *Sippel, A.E. (2003) Genomic organization, splice products and mouse chromosomal localization of genes for transcription factor Nuclear Factor One. Gene 304, 171-181 [29] Berrar, D., Dubitzky, W., Solinas-Toldo, S., Bulashevska, S., Granzow, M., Conrad, C., Kalla, J., Lichter, P., Eils, R. (2001) A database system for comparative genomic hybridization analysis. IEEE Eng. Med. Biol. Mag. 20, 75-83 [30] *Wessendorf, S., Fritz, B., Wrobel, G., Nessling, M., Lampel, S., Goettel, D., Kuepper, M., Joos, S., *Hopman, T., Kokocinski, F., *Döhner, H., *Bentz, M., Schwaenen, C., Lichter, P. (2002) Automated screening for genomic imbalances using matrix-based comparative genomic hybridization (matrix-CGH). Lab. Invest. 82, 47-60 [31] *Wessendorf, S., Schwaenen, C., *Kohlhammer, H., Wrobel, G., *Barth, T., Nessling, M., *Möller, P., *Döhner, H., Lichter, P., *Bentz, M. (2003), Hidden gene amplification in aggressive B-cell non-Hodgkin lymphoma detected by microarray based comparative genomic hybridization. Oncogene 22, 14251429 [32] *Kohlhammer, H., Schwaenen, C. *Wessendorf, S., *Holzmann, K., *Kestler, H.A., *Kienle, D., *Barth, T.F.E., *Möller, P., *Ott, G., Kalla, J., Radlwimmer, B., Pscherer, A., *Stilgenbauer, S., *Döhner, H., Lichter, P., *Bentz, M. (2004) Genomic DNA-chip hybridization in t(11:14)-positive mantle cell lymphomas shows a high frequency of aberrations and allows a refined characterization of consensus regions. Blood (in press) [33] *Wessendorf, S., Lichter, P., Schwaenen, C., Fritz, B., Baudis, M., *Walenta, K., *Kloess M., *Döhner, H., *Bentz, M. (2001) Potential of chromosomal and matrix-based comparative genomic hybridization for molecular diagnostics in lymphomas. Ann. Hematol. 80 Suppl. 3, B35-37 [34] Schwaenen, C., *Wessendorf, S., *Kestler, H.A., *Döhner, H., Lichter, P., *Bentz, M. (2003) DNA microarray analysis in malignant lymphoma. Ann. Hematol. 82, 323-332 [35] Joos, S., *Hofele, C., Lichter, P. (2003) Was kann die Genomforschung zur Verbesserung der Diagnostik von Krebserkrankungen beitragen? Onkologie heute 3, 10-14 [36] Schwaenen, C., Nessling, M., *Wessendorf, S., Salvi, T., Wrobel, G., Radlwimmer, B., *Kestler, H., *Haslinger, C., *Stilgenbauer, S., *Döhner, H., *Bentz, M. and Lichter, P. (2004) Automated array based genomic profiling in chronic lymphocytic leukemia: Development of a clinical tool and discovery of new recurrent genomic alterations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 1039-1044 [37] Wrobel, G., Schlingemann, J., Hummerich, L., Kramer, H., Lichter, P., Hahn, M. (2003) Optimization of high-density cDNAmicroarray protocols by „Design of Experiments”. Nucleic Acids Res. 31, e67 [38] Neben, K., *Giesecke, C., Tews, B., Wrobel, G., Hahn, M., *Krause, U., *Ho, A.D., Lichter, P., *Krämer, A. (2004) Gene expression patterns in acute myeloid leukemia correlate with centrosome aberrations and numerical chromosome changes. Oncogene 23, 2379-2384 [39] Fritz, B., Kokocinski, F., Schlingemann, J., Hahn, M. (2003) Anwendungen der DNA-Chiptechnologie in der Krebsforschung. BIOspektrum 9, 78-83

DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003

Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung

Abteilung B060 Molekulare Genetik

[40] Korshunov, A., Neben, K., Wrobe,l G., Tews, B., Benner, A., Hahn, M., *Golanov, A., Lichter, P. (2003) Gene expression patterns in ependymomas are correlated to tumor location and patient age. Am. J. Patho.163, 1721-1727 [41] Neben, K., Korshunov, A., Benner, A., Wrobel, G., Hahn, M., *Golanov, A., Joos, S., Lichter, P. (2004) Microarray-based screening for molecular markers in medulloblastoma revealed STK15 as independent predictor for survival. Cancer Res. 64 (in press) [42] Kokocinski, F., Wrobel, G., Hahn, M., Lichter, P (2003) QuickLIMS: facilitating the data management for DNA-microarray fabrication. Bioinformatics 19, 283-284 [43] Schlingemann,J., Hess, J., Wrobel, G., Breitenbach, U., Gebhardt, C., Steinlein, P., Kramer, H., Fürstenberger, G., Hahn, M., Angel, P., Lichter, P. (2003) Profile of gene expression induced by the tumor promotor TPA in murine epithelial cells. In. J. Cancer 104, 699-708 [44] Görisch, S.M., Richter, K., Scheuermann, M.O., Herrmann, H., Lichter, P. (2003) Diffusion-limited compartmentalization of mammalian cell nuclei assessed by microinjected macromolecules. Exp. Cell Res. 289, 282-294

DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003

135